番茄褪绿病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法

根据番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,ToCV)热激蛋白70(Hsp70)的基因序列,设计ToCV实时荧光定量PCR特异引物。利用重组质粒ToCV-1为标准品建立SYBR Green Ⅰ实时荧光定量方法。针对引物浓度、退火温度、特异性、灵敏度、重复性和稳定性进行系列优化。结果表明,最适退火温度为63℃,最适引物浓度为0.3μmol·L~(-1)。熔解曲线为特异性单峰,表明其特异性良好。建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR较常规PCR灵敏100倍,且具有良好的重复性和稳定性。基于SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR技术建立的ToCV检测方法,速度快、特异性强、灵敏度高、重复性好,可以用于ToCV的定量检测。     

番茄褪绿病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR方法

 根据番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus, ToCV)热激蛋白70(Hsp70)的基因序列,设计ToCV实时荧光定量PCR特异引物。利用重组质粒ToCV-1为标准品建立SYBR Green I实时荧光定量方法。针对引物浓度、退火温度、特异性、灵敏度、重复性和稳定性进行系列优化。结果表明,最适退火温度为63℃,最适引物浓度为0.3 μmol·L^-1。熔解曲线为特异性单峰,表明其特异性良好。建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR较常规PCR灵敏100倍,且具有良好的重复性和稳定性。基于SYBR Green I实时荧光定量PCR技术建立的ToCV检测方法,速度快、特异性强、灵敏度高、重复性好,可以用于ToCV的定量检测。     

山东省辣椒主要病毒种类的分子检测与鉴定

【目的】鉴定山东省辣椒上的主要病毒种类,明确该地区辣椒上的主要病毒病原。【方法】2014—2015年,在山东省临沂、日照、青岛、烟台、潍坊、淄博、济宁、菏泽、聊城、德州共10个市(区)采集253份疑似感病的辣椒植株叶片,提取叶片总RNA和总DNA,利用双生病毒的通用引物(PA/PB)、马铃薯卷叶病毒属通用引物(POL-F/POL-R)及已报道侵染辣椒的主要病毒的检测引物对样品进行PCR、RT-PCR分子检测与鉴定,将扩增得到的目的条带经凝胶回收试剂盒回收纯化后连接到pMD18-T载体上,再送至公司进行克隆测序。分别将所得的PMMoV、PeVYV和BWYV序列在NCBI上利用BLAST进行检索,利用DNAStar软件中的Megalign将所得序列与Gen Bank中已登录的世界各地有代表性的序列进行同源性比对,利用软件MEGA 5.05的Clustal W法进行多序列比对分析以及邻接法(neighbor-joining,NJ)构建系统进化树,系统进化树中各分支置信度(Bootstrap)进行1 000次重复分析。【结果】PMMoV、CMV总检出率分别为61.66%、60.08%;TMGMV、BBWV-2、BWYV、TMV发生也比较普遍,检出率为41.90%、34.78%、33.20%和24.90%;PCV-2、ToMV、TYLCV、PVY、MABYV、PeVYV、PCV-1、ChiVMV、AMV发生侵染现象较少,检出率分别为11.86%、9.88%、9.09%、6.72%、5.53%、3.56%、3.16%、0.79%和0.40%;未检测到Ca CV、PSV、Chi RSV、TSWV和To MMV。通过对病毒复合侵染现象进行分析发现,病毒复合侵染率高达89.92%,其中3种病毒复合侵染现象最多,所占比例达28.63%,4种病毒复合侵染率为25.00%,2种病毒复合侵染率为21.77%,5种病毒复合侵染率为13.31%,一个辣椒样品最多可同时感染6种病毒,侵染率为1.21%;对山东省10个地区的辣椒病毒检测,结果表明在辣椒上检出病毒种类最多的为临沂、济宁,检测到12种病毒,其次是烟台、聊城,检测到11种病毒,潍坊、菏泽检测到9种病毒,青岛、德州检测到8种病毒,日照检测到7种病毒,淄博检测到6种病毒,日照地区辣椒病毒复合侵染率最高,为100%,菏泽地区复合侵染率最低,为69.23%。分别根据PMMoV的部分CP基因序列、PeVYV部分Rd Rp、CP、MP基因序列以及BWYV部分CP、MP基因序列构建系统发育树,结果表明本研究PMMoV山东分离物SD60与中国贵州分离物的亲缘关系最近,PeVYV山东分离物SDRZ31-1与意大利IT83分离物的亲缘关系最近,BWYV山东分离物SD与韩国分离物LS的亲缘关系最近。【结论】在山东省采集的253份辣椒样品可被15种病毒侵染,PMMoV、CMV为主要病毒种类;在山东新检测到的病毒有MABYV、PeVYV、BWYV、PCV-1和PCV-2;明确了山东省主要辣椒产区病毒病发生情况以及病毒种类的主次关系。     

北方四省区番茄褪绿病毒的分子鉴定

2015-2016年间,在山西省、内蒙古自治区、辽宁省、吉林省采集到疑似感染番茄褪绿病毒Tomato chlorosis virus(ToCV)的番茄植株。利用扩增ToCV外壳蛋白(coat protein,CP)和类热激蛋白(heat shock protein 70homolog,HSP70h)基因片段的两对特异性引物,通过RT-PCR对疑似样品进行分子检测,得到970bp和1 864bp的特异条带,经测序、比对确定为ToCV。序列分析表明,山西晋中分离物SXJZ(KX853540)的CP核苷酸序列与河南安阳分离物HNAYHX(KP264983)相似性为99.7%,内蒙古呼和浩特分离物NMHHHT(KU204709)和辽宁大连分离物LNDL(KU204707)的CP核苷酸序列与国内已报道的山东寿光分离物SDSG(KC709510)相似性分别为99.5%和99.7%,吉林长春分离物JLCC(KU306111)的CP核苷酸序列与山东聊城分离物SDLC(KC812622)的相似性为99.8%。而HSP70h核苷酸序列的相似性分析表明,山西晋中分离物SXJZ(KX853539)与日本分离物Tochigi(AB513442)相似性为99.4%,内蒙古呼和浩特分离物NMHHHT(KU204710)、辽宁大连分离物LNDL(KU204708)和吉林长春分离物JLCC(KX880384)与山东寿光分离物SDSG(KC709510)相似性分别为99.7%、99.8%和99.7%。试验结果明确了番茄褪绿病毒已蔓延传播到我国山西、内蒙古及东北地区。