咖啡酸苯乙酯通过AMPK/FOXO3a信号通路缓解猪精液常温保存氧化应激的作用机制

【目的】探究咖啡酸苯乙酯（caffeic acid phenethyl ester,CAPE）通过AMPK/FOXO3a信号通路缓解氧化应激对猪精液的影响及其分子机制。【方法】选取8头成年（1—2岁）、健康状况良好长白种公猪进行鲜精采集,将质检合格的样品混池待用。试验设计如下：首先,在常温基础稀释液中分别添加0、0.02、0.04、0.06、0.08和0.10 g·L^-1浓度的CAPE,将精液样品与各个浓度组依次混合后放置室温平衡,随即转入17 ℃电子恒温冰箱进行常温保存。全自动精子分析仪（CASA）测定1—5 d精子运动学参数（总活率与渐进性活力）,筛选出最佳适宜浓度为0.06 g·L^-1。其次,将0.06 g·L^-1 CAPE与400 μmol·L^-1的H₂O₂建立氧化胁迫模型,在第1、3、5天分别采用CASA测定精子总活率与渐进性活力,荧光探针技术评估质膜完整性与顶体完整性,抗氧化试剂盒检测过氧化氢酶（catalase,CAT）与超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性,在第5 天利用实时荧光定量 PCR技术测定AMPK/FOXO3a信号通路下游靶向基因（AMPK、FOXO3a、SOD1、SOD2、CAT）及凋亡基因BAX的mRNA表达水平,蛋白免疫印记技术测定AMPK、p-AMPK蛋白表达。【结果】（1）浓度筛选试验中,0.06 g·L^-1的CAPE在保存第3 天显著提高精子的总活率并维持至第5天（P<0.05）,不仅如此,精子的渐进性活力在第1 天显著高于其他处理组（P<0.05）。（2）氧化胁迫试验中,H₂O₂处理组的精子质膜完整性、顶体完整性、总活率、渐进性活力、SOD与CAT活性在保存的第5天均极限显著低于空白组与CAPE+H₂O₂混合组（P<0.001）,而空白组与CAPE+H₂O₂混合组的总活率、顶体完整性、CAT与SOD活性不存在显著差异（P>0.05）。与CAPE+H₂O₂混合组相比,H₂O₂处理组AMPK、FOXO3a、SOD1、SOD2、CAT的mRNA表达水平显著降低（P<0.05）,BAX的表达水平显著升高（P<0.05）,而空白组与CAPE+H₂O₂混合组的AMPK、SOD1、CAT与BAX不存在显著差异（P>0.05）。在蛋白表达水平中,CAPE+H₂O₂混合组与H₂O₂组相比,AMPK、p-AMPK 与p-AMPK/AMPK比率显著提升（P <0.05）。【结论】在常温基础稀释液中添加0.06 g·L^-1CAPE可通过促进磷酸化AMPK的表达,诱导AMPK/FOXO3a信号下游抗氧化分子的转录,继而缓解H₂O₂介导的氧化危害对精液品质产生的影响,延长精液的保存时间,但CAPE保护精子氧化损伤更为深入的分子机制仍需作进一步探究。     

贵州务川黑牛mtDNA Cytb基因遗传多样性研究*

 务川黑牛是贵州省新近发现的独特地方品种,其起源和系统地位尚存争议。测定了22个务川黑牛的Cyt b基因全序列,结合已报道的中国9个黄牛品种17个个体的Cyt b基因全序列进行分析,结果显示：务川黑牛的Cytb基因全长1140 bp,共检测到21个核苷酸多态位点。碱基A+T平均含量为567%,显著高于G+C平均含量43.4%,第3密码子表现出较强的碱基组成偏倚。定义了8种单倍型且突变类型仅存在转换,表明务川黑牛的Cyt b基因的遗传多态性较为丰富。邻接法(NJ）构建的分子系统树表明,务川黑牛有2个母系起源即普通牛起源和瘤牛起源。     

天柱黑番鸭催乳素基因内含子1的PCR-RFLP分析

利用PCR-RFLP技术,对天柱黑番鸭和白羽番鸭的催乳素(Prolaction,PRL)基因内含子1进行了酶切和序列分析。结果表明:PRL基因内含子1存在两个DraI酶切位点,其中1个位点具有DraI多态性。该位点由于在1 326 bp位置发生了A→G的碱基突变,产生了AA、AB和BB3种基因型。其中,BB基因型频率在天柱黑番鸭和白番鸭中分别为0.714 3和0.705 9,B等位基因频率在两组番鸭中相应为0.821 4和0.794 1。χ2检验表明,基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡,因此,BB基因型为优势基因型,B基因为优势等位基因。     

鸭坦布苏病毒检测方法及疫苗研究进展

鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)是黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)的一种新发蚊媒病毒,其引起的疫病在临床上以蛋鸭产蛋量下降和雏鸭神经系统损伤为特征,给国内养鸭业造成了重大的经济损失。DTMUV感染自2010年在上海市暴发后,逐渐向中国东部、东南部和北部主要鸭养殖场扩散。目前国内已建立了多种用于DTMUV临床诊断或实验室检测方法。DTMUV的分离鉴定和免疫组化用于检测病毒颗粒的存在;DTMUV的血清学检测方法主要包括间接ELISA、竞争ELISA和胶体金免疫层析条等,可检测DTMUV的特异性蛋白或抗体,广泛应用于DTMUV的现场检测;以常规PCR、多重PCR及CRISPR技术为主的病毒核酸检测方法实现了DTMUV的快速临床诊断,促进了鸭坦布苏病毒病的流行病学调查和致病机制研究。随着部分疫苗的开发和商业化,中国DTMUV感染的流行强度也由暴发逐渐转变为零星散发。但DTMUV的宿主范围较广,传播途径多样且具有潜在的人畜共患性,为及早发现并控制DTMUV的传播,建立快速、准确的检测方法和安全有效的疫苗显得尤为重要。笔者对DTM...     

河田鸡与白绒乌骨鸡MC1R基因序列分析

为了比较白绒乌骨鸡和河田鸡的黑素皮质素受体1(melanocortin 1 receptor,MC1R)基因序列的差异,试验以NCBI上的红原鸡MC1R基因序列(AB201630)为参照,进行PCR扩增和基因序列比对,并分析了氨基酸序列与蛋白质结构。结果表明:白绒乌骨鸡和河田鸡MC1R基因的序列长度均为945 bp,河田鸡与红原鸡序列同源性为99. 70%,白绒乌骨鸡与红原鸡序列同源性为99. 20%,而河田鸡与白绒乌骨鸡序列同源性为99. 0%;河田鸡相对于红原鸡有2处突变(T143A和C213R),白绒乌骨鸡相对于红原鸡有6处突变(M71T、E92K、L133P、A137T、C213R和H215P),河田鸡相对于白绒乌骨鸡有6处突变(M71T、E92K、L133P、A137T、A143T和H215P);河田鸡和白绒乌骨鸡MCIR基因的二级结构区中α-螺旋、β-折叠、无规则卷曲所占比例分别为55. 73%、8. 92%、35. 35%和52. 55%、12. 42%、35. 03%,均有7个跨膜区,白绒乌骨鸡和河田鸡的三维结构差异主要发生在跨膜区;在鸡形目动物中,MC1R基因具有较高的保守性。说明白绒乌骨鸡MC1R基因突变导致其编码的氨基酸序列H215P异常,推测鸡体内抑制黑色素在羽毛沉积的表征可能由该突变导致。     

鱼类抗冻蛋白在动物精液、细胞、胚胎低温保存中的研究进展

抗冻蛋白（antifreeze proteins,AFPs）是一类能抑制冰晶生长并提高机体抗冻功能的蛋白质。AFPs来源广泛,在动物、植物、细菌、真菌等不同生物体内都存在。目前,研究较多、有望被推广应用于畜牧生产实践的主要是具有热滞活性和抑制冰晶重结晶活性的鱼类AFPs。鱼类AFPs的种类主要包括AFPⅠ、AFPⅡ、AFPⅢ、AFPⅣ和抗冻糖蛋白（AFGP）。尽管不同鱼类AFPs都具有抗冻功能,但是它们的组成和结构差异很大,而且对应的基因在核苷酸序列上几乎没有相似性。鱼类AFPs抗冻机制主要包括吸附-抑制学说、刚体能量学说、包合物锚定学说、亲和相互作用偶联团聚学说等。在人类、鱼类、家畜和小鼠等精液的低温保存中,鱼类AFPs可通过维持细胞膜完整性、抑制冰晶生长及减少DNA损伤等保护精子;在卵母细胞、精原细胞、红细胞及动物胚胎的低温保存中,鱼类AFPs可通过阻止冰晶化及抗氧化功能等改善保存效果。作者主要概述了鱼类AFPs种类及其结构特征和作用机制,总结了鱼类AFPs在精液、卵母细胞、精原细胞、红细胞及胚胎低温保存中的应用进展,以期为鱼类AFPs作为候选抗冻剂应用于种质资源保护和畜牧业生产提供科学依据。     

利用微卫星标记分析云南矮马的遗传多样性

为云南矮马资源的保护、开发和利用提供科学依据,采用11个微卫星标记对35匹云南矮马进行遗传多样性分析,计算各微卫星位点的等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、多态信息含量(PIC)、杂合度(H)并进行了哈代-温伯格平衡检验。结果表明,各位点平均等位基因数8.55,平均有效等位基因数6.33,平均多态信息含量0.81,平均杂合度0.84,处于哈代-温伯格不平衡状态。说明,云南矮马的遗传多样性较丰富。     

莆田黑鸭蛋品质及羽色遗传规律分析

本实验以莆田黑鸭为素材,从羽色及蛋品质的角度对其进行种质特性研究。以羽色稳定遗传的莆田黑鸭和莆田白鸭为亲本进行正反杂交,F1代个体进行自群繁育获得F2代个体,观察2个世代的羽色情况。选取产蛋初期莆田黑鸭所产的白壳、青壳和黑壳蛋各30枚,测定蛋重、蛋壳强度、蛋白高度、哈氏单位、蛋黄颜色、蛋壳厚度、蛋黄重、蛋形指数和蛋黄比例,并进行分析。结果显示：F1代入孵种蛋634枚,出雏448只,公母比为208:240,羽色均为黑色;F1代群体自群繁育获得F2代种蛋,入孵344枚,出雏288只,公母比为119:169,羽色发生分离,黑羽:白羽为206:82;黑壳蛋的各项指标（蛋形指数除外）均显著或极显著低于白壳和青壳蛋,白壳和青壳蛋的大多数指标没有差异;在青壳蛋中,蛋重与蛋黄颜色呈显著相关。结果表明：莆田黑鸭黑-白羽性状的遗传符合单基因分离定律,白羽为隐性性状,控制该性状的基因位于常染色体上;莆田黑鸭白壳与青壳蛋的主要区别在于蛋壳颜色,黑壳蛋的蛋品质相对较差。     

猪糖原合酶激酶3β基因的克隆、染色体定位和组织表达谱分析

糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β, GSK3β)是一种在机体内分布广泛且结构高度保守的丝/苏氨酸蛋白激酶。本研究利用电子克隆的方法克隆了猪GSK3β(sGSK3β)基因的编码区序列;用猪－仓鼠体细胞辐射杂种板(IMpRH)对其进行了染色体定位;用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的方法,以10个不同组织样品cDNA为模板对sGSK3β的组织表达谱进行了分析。研究结果表明,sGSK3β基因的编码区有1263个核苷酸,编码420个氨基酸,其氨基酸序列与人、大鼠、小鼠和斑马鱼同源性分别为95.6%、98.8%、98.8%、93.3%;sGSK3β基因定位于猪的13q41-46,与标记SW1876紧密连锁。组织表达谱分析结果表明sGSK3β基因在猪的10种组织中存在着表达量的差异,在肝脏和肺脏中高表达,在脂肪、肾脏、脾脏、大脑和小脑中次之,而在心脏、胃和肌肉中只检测到本底表达。     

莆田黑猪不同组织DNA甲基化的MSAP分析

为研究莆田黑猪不同组织间基因组DNA甲基化水平差异及各组织甲基化水平在不同生长发育阶段之间的变化规律,采用甲基化敏感扩增片段多态性(MSAP)方法检测了1、25和210日龄莆田黑猪的心脏、肝脏、肌肉、脂肪、耳和尾6个组织基因组DNA的甲基化水平.结果表明:心脏和肝脏组织的甲基化水平随日龄增长呈下降趋势,且日龄间的甲基化水平差异显著(P0.05);25日龄肌肉组织的甲基化水平与1日龄的差异不显著(P0.05),但显著高于210日龄(P0.05);25日龄脂肪和耳组织的甲基化水平显著高于1和210日龄(P0.05);3个日龄间尾组织的甲基化水平差异不显著(P0.05);3个日龄的肝脏与脂肪组织之间、肝脏与耳组织之间的甲基化水平均存在显著差异(P0.05),表明DNA甲基化在肝脏与脂肪组织之间、肝脏与耳组织之间存在组织特异性.