标准模块化设计在基因工程实验课程教学中的应用

针对目前基因工程实验课程存在的不足,根据该课程内容的特点进行模块化设计,将相关的实验课程划分成多个可以独立授课的模块,每一个模块都包含标准化的基础实验技能,而这些模块又可以组成系统一体化的综合实验,让学生先按照顺序掌握基本模块的实验操作基本技能,并对单个模块的实验技能进行考核,合格后才能进入下一步实验,这将可以大大提高基因工程实验课的教学效果,并促进学生对理论知识的掌握和实验技能的提高。     

温泉土壤宏基因组文库构建及普鲁兰酶筛选

[目的]构建温泉土壤宏基因组文库并进行普鲁兰酶活性筛选,以期获得高活力、耐高温的新型普鲁兰酶基因.[方法]采用间接法提取温泉土壤样品中宏基因组DNA,经Sephadex G200（含2％ PVPP）凝胶柱和电洗脱两步纯化后,扩增16S rRNA序列,通过序列比对和系统发育进化树分析温泉土壤微生物的多样性;然后以pCC1FOS为载体构建温泉土壤宏基因组文库,并对所获得的宏基因组文库进行活性筛选.[结果]利用宏基因组技术提取温泉土壤样品中微生物的基因组DNA,构建了一个约含1 146个克隆的温泉土壤16S rRNA文库,经遗传进化分析,发现温泉土壤样品中的大部分微生物未被研究过,主要来源于厚壁菌门（Firmicutes）,其次为恐球菌—栖热菌门（Deinococcus-Thermus）和变形杆菌门（Proteobacteria）.用提取获得的宏基因组DNA成功构建了温泉土壤微生物宏基因组Fosmid文库,文库约含2.7万个克隆,平均插入片段长度为40.0 kb,文库外源DNA总容量为1.2×10^9bp;通过活性筛选共获得9个可表达普鲁兰酶活性的克隆.[结论]宏基因组文库技术是获取极端环境微生物新酶的有效手段,可为进一步挖掘普鲁兰酶的应用潜力及研究其耐热机理奠定基础.     

加强农机管理对促进当地农业发展的重要性研究

加快社会主义新农村建设,提高农业生产力是本质要求。科学技术带动农业技术发展,促进农村改革的进一步深化,推动农机化水平不断提高。近些年来,农村机械设备管理在农机化的发展道路上备受重视,成为了推动农业现代化建设的中坚力量。本文针对农机管理对促进当地农业发展进行了研究。     

基于非理性设计的肺炎克雷伯氏杆菌甘油脱水酶的分子定向进化

1,3-丙二醇是一种具有广泛应用前景和巨大市场潜力的平台化合物。在生物体转化甘油合成1,3-丙二醇的代谢途径中,甘油脱水酶是代谢途径的限速酶,然而自然界中的甘油脱水酶却存在着诸多的不足。本研究采用易错PCR技术对来源于肺炎克雷伯氏杆菌的甘油脱水酶进行非理性设计的分子定向进化,通过高通量筛选方法筛选获得了一个酶学性质得到了改善的突变酶γ-F97G。当以甘油作为酶催化的底物时,突变酶的酶比活力为（583.8±49.4）U/mg,相比较野生型的酶比活力提高了约94%;当以1,2-丙二醇作为酶催化底物时,突变酶的酶比活力为（147.9±5.5）U/mg,相比较野生型的酶比活力提高了约72%。经分析酶蛋白的三维结构后发现酶蛋白发生突变的位点属于远距离突变位点,实验结果表明远距离突变有时同样是一条优化和改善酶的酶学性质的好途径。     

绿色木霉葡聚糖内切酶Ⅰ基因的定点突变及酶学性质的研究

将绿色木霉葡聚糖内切酶EGⅠ基因eg1亚克隆到表达载体pSE380,构建出重组质粒pSE380-eg1,转化到大肠杆菌JM109中表达,利用金属亲和层析对EGI进行纯化,纯化后的酶比活力达到3.8U/mg,其最适反应温度为48℃,最适pH为5.2。同时对EGⅠ的氨基酸残基G291位进行随机定点突变,筛选到一株突变酶G291S,其比活力为野生酶的2.2倍,Km值为野生酶的0.66倍,最适反应温度和最适反应pH值未发生改变。     

宏基因组中不依赖辅酶B12甘油脱水酶基因的筛选和表达

通过特定的引物,以土壤宏基因组DNA为模板,采用PCR技术扩增获得3．3kb的DNA片段,该片段连接于pSE380载体构建重组质粒pSE380-dhaB12用于测序和表达。序列分析表明,该DNA片段编码的氨基酸序列与已报导的丁酸梭菌不依赖辅酶B12甘油脱水酶的相似性达99％。通过IPTG诱导,dhaB12基因在大肠杆菌中表达成功,SDS—PAGE分析表明有88kD和34kD两条蛋白质条带,在没有辅酶B12存在的情况下,所表达的酶具有明显的甘油脱水酶活性。     

宏基因组文库中的组成型启动子在大肠杆菌中的克隆

启动子是决定基因表达水平的重要因素之一。组成型表达启动子被认为是工业上表达重要蛋白质的理想启动子。本研究利用蔗糖为唯一碳源的基本培养基对榨糖废水浸润的土壤微生物宏基因组文库进行筛选,获得两个阳性克隆。对其中一个克隆的柯斯质粒进行亚克隆,利用在线启动子预测和序列比对工具对其中一个亚克隆子进行分析,获得一个启动子序列。然后,利用PCR方法将该启动子和地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶基因一起克隆到T载体上。结果表明该启动子在不加诱导剂的条件下能够在大肠杆菌中启动外源基因的高效表达。本研究结果为在生物领域中组成型启动子的应用研究提供了基础。