香石竹斑驳病毒单克隆抗体的制备及检测应用

 用香石竹斑驳病毒(CarMV)免疫的BALB/c鼠脾细胞与Sp2/0鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选克隆,获得5株能稳定传代且分泌抗CarMV单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞,并分别制备它们的单克隆抗体腹水。5株单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10^-6,其中3G1、1B9、2A9和2F8的抗体类型及亚类均为IgG1,而2F₂为IgG3。Western-blot分析表明,5株单克隆抗体均与CarMV 38 kD的外壳蛋白亚基有特异性反应。利用2A9单抗建立的抗原包被的间接ELISA (ACP-ELISA)检测CarMV方法,病叶1:800倍稀释、提纯CarMV病毒浓度为1 ng/mL (绝对检测量为0.1 ng)时仍能检测到病毒。利用ACP-ELISA对田间香石竹样品的检测表明,CarMV在香石竹上发病很普遍。     

云南怒江番茄种植新区番茄病毒检测及病毒种传特性

病毒病对番茄生产造成严重危害, 近年来在番茄种植新区发生严重, 疑似为种子带毒传播。本研究通过对云南省怒江州番茄种植新区的番茄病毒病样品采用RNA-seq高通量测序, RT-PCR验证的方法检测病毒种类;对番茄病果种子进行超薄切片制样透射电子显微镜观察, 将病果种子播种后对种苗进行RT-PCR带毒检测。结果表明, RNA-seq高通量测序及RT-PCR检测到的病毒有番茄环纹斑点病毒(tomato zonate spot orthotospovirus, TZSV)、番茄黄斑驳相关病毒(tomato yellow mottle-associated virus, TYMaV)、辣椒脉斑驳病毒(chili veinal mottle virus, ChiVMV)、南方番茄病毒(southern tomato virus, STV)。透射电镜观察到种胚细胞及胚乳细胞中分布典型的正番茄斑萎病毒属Orthotospovirus病毒粒体。病果种子播种28 d后的种苗具有病毒病症状, 通过RT-PCR检出TZSV、ChiVMV、STV, 检出率分别为60%、100%、80%。上述研究结果为TZSV通过种子传播提供了有利的证据, 并为源头防控番茄病毒病提供了依据。     

复合侵染水茄的两种菜豆金色花叶病毒属病毒基因组结构特征分析

为明确水茄Solanum torvum植株叶片邹缩、褪绿是否由菜豆金色花叶病毒属病毒侵染引起,从云南省西双版纳傣族自治州田间采集具有疑似感染症状的水茄植株叶片样品,应用菜豆金色花叶病毒属病毒简并引物和特异性引物进行PCR扩增、克隆和测序,通过生物信息软件分析比较其核苷酸序列特征,并对其进行系统发育分析。结果显示,从采集的疑似病叶中共克隆获得了5条菜豆金色花叶病毒属病毒DNA-A全序列和3条DNA-B全序列,经全序列分析发现,侵染水茄的2种菜豆金色花叶病毒属病毒分离物分别属于中国南瓜曲叶病毒(squash leaf curl China virus,SLCCNV)和野茼蒿黄脉病毒(Crassocephalum yellow vein virus,CraYVV)。SLCCNV水茄分离物的基因组具有典型的菜豆金色花叶病毒属病毒双组分结构特征,与来自泰国的SLCCNV分离物(AB330078)亲缘关系最近,相似性最高达到99.0%;CraYVV水茄分离物的基因组具有典型的菜豆金色花叶病毒属病毒单组分结构特征,与来自云南省景洪市的CraYVV分离物(EF165536)亲缘关系最近,相似性最高达到97.6%。表明水茄是这2种菜豆金色花叶病毒属病毒的新寄主,并首次发现双组分和单组分菜豆金色花叶病毒属病毒可复合侵染水茄。     

野茼蒿黄脉病毒的田间寄主范围及其基因多样性特征

为明确野茼蒿黄脉病毒(Crassocephalum yellow vein virus,CraYVV)的田间寄主范围及其群体基因结构特征,分别采用克隆和测序技术对采自云南省西双版纳傣族州、红河哈尼族彝族自治州的7种杂草和2种作物进行CraYVV的分离和鉴定,并通过生物信息学软件对分离到的CraYVV进行基因组结构、重组及基因遗传结构分析。结果显示,在赛葵、龙葵、臭牡丹、水茄、豨莶、野茼蒿和一点红7种杂草以及茄子和草莓2种作物中均分离到CraYVV,共获得20条CraYVV全长序列;CraYVV所有分离物分属2个株系,将其命名为YJ株系和JH株系;JH株系具有地理隔离特征,与YJ株系存在一定的遗传距离;重组分析显示,CraYVV是由烟草曲茎病毒(tobacco curly shoot virus,TbCSV)和云南烟草曲叶病毒(tobacco leaf curl Yunnan virus,TbLCYnV)重组产生;遗传结构分析显示,CraYVV中C1基因变异最显著,其次是C4基因和基因间隔区。表明CraYVV能侵染5科9种杂草和作物,具有较广的寄主范围,且菜豆金色花叶病毒属病毒能够侵染草莓、CraYVV能够侵染茄子,显示来源于杂草的菜豆金色花叶病毒属病毒在自然条件下能够侵染作物。     

云南香料烟花叶病病原分离物的鉴定

从云南保山采集具典型花叶症状的香料烟病株，用病株汁液接种心叶烟，进行单斑分离纯化。电子显微镜观察到杆状病毒粒体（18nm×300nm），三抗体夹心酶联免疫吸附（TAS-EUSA）检测与烟草花叶病毒（Tobaccomma／cv／nu，TMV）抗血清呈阳性反应；用TMV外壳蛋白（CP）基因特异性引物进行RT-PCR扩增，克隆，经序列测定分析，侵染云南保山香料烟的病原分离物CP基因含480个核苷酸，编码159个氨基酸，通过核苷酸和氨基酸序列分析，与TMV-152的相似性最高，核苷酸序列的相似性为98．8％，推导编码氨基酸相似性达到100．0％，亲缘关系最近。根据这些特性，引起云南保山香料烟花叶病的病原分离物是烟草花叶病毒的一个分离物。     

云南省烟草病毒病发生状况的电镜研究及其防治

 对云南烟草病毒病进行了调查采样,应用病毒分离提纯技术、电子显微镜技术开展鉴定研究,得出:(1)烟草病毒病在田间的症状以花叶病为主,但多为复合症状,诊断价值不大;(2)云南烟草病毒病原以烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、马铃薯病毒Y (PVY)为主、烟草蚀纹病毒(TEV)发生较为普遍,但为害不严重,此外有马铃薯病毒X (PVX)一种球形病毒[可能是番茄斑萎病毒(TSWV)]也有零星发生,以症状来看,还有环斑、曲叶、丛枝、条纹等类型,但未分离到明显的病原;(3)病毒病原的分布在云南主要烤烟栽培品种上没有明显差异,而与采集地点不同有明显的不同,即其分布主要与生态类型有关.同时,对烟草病毒病重病区宾川开展了集中采样鉴定研究并进行了初步防治试验.     

烟草曲叶病病原的鉴定及其细胞病理

应用电镜技术，结合粉虱传双生病毒的多抗血清和单克隆抗体采用免疫电镜（ISEM）和三抗体夹心酶联免疫吸附测定（TAS－ELISA），对云南烤烟、香料烟和白肋烟3种类型烟草上的曲叶病病原进行了检测鉴定，其病原为粉虱传双生病毒（WTG）；根据单克隆抗体分析表位抗原，可分为3组，其中香料烟曲叶病分离物中三者皆有，烤烟和白肋烟曲叶病分离物与香料烟曲叶病的一个分离物同属一组表位抗原类型；对3种烟草曲叶病的病原细胞进行了观察，在核内观察到典型的纤维环，细胞核和细胞质内都含大量的双生病毒颗粒，在细胞质中有病毒颗粒的聚集块，在胞间连丝中观察到病毒颗粒。     

番茄斑萎病毒属(Tospovirus)病毒在云南的发生分布研究初报

应用电子显微镜观察形态学及细胞病理特征,间接酶联免疫吸附测定(I-ELISA)和双抗体夹心EUSA(DAS-ELISA),部分样品经番茄斑萎病毒(TSWW)核壳体蛋白基因(N-gene)的反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增,以及部分样品的生物学回接测定的方法,对采自云南不同地区20种寄主植物上204份疑似Tospovirus侵染的病株样品进行了检测.结果表明,共有20种寄主作物139份样品中含有Tospovirus分离物,从检出样品的分布看,云南全省均有分布,但在海拔2400m以上的地区其症状表现不明显.Tospovirus云南分离物在血清型、细胞病理特征以及寄主范围方面与国内外报道的同属病毒有共同的特征,同时也有较明显的差异,即云南存在有Tospovirus新的株系或种类.