Loxp序列位置对基因表达的影响

【目的】先选用绿色荧光蛋白基因（egfp）作为试验基因构建loxp位点位于egfp基因上游或下游不同位置的表达结构,对loxp位点的位置对基因表达的影响进行初步分析。然后以植酸酶（phytase）基因为另一个试验基因对通过egfp基因得出的结果进行进一步验证。研究结果为开展通过基因打靶技术将外源基因与内源基因通过2A序列连接共表达的转基因动物制作中,打靶位点的选择提供可靠依据。【方法】先选择增强绿色荧光蛋白基因（egfp）为试验基因,红色荧光蛋白基因（dsred2）为内参基因。以pEGFP-N2、pGEM-5zf-loxp质粒为基础,构建了ploxp-EGFP（loxp序列位于egfp基因开放阅读框的Kozak序列上游的5′非翻译区）、pEGFP-loxp（loxp序列位于egfp基因开放阅读框的终止密码子下游的3′非翻译区）、ploxp-EGFP-loxp（egfp基因开放阅读框的Kozak序列上游5′非翻译区和终止密码子下游3′非翻译区各有一个loxp序列）。以pEGFP-N2质粒为对照质粒,以pDsRed2-N1为内参质粒,与所构建的egfp基因各表达质粒共转染PK15细胞,转染24h后在荧光显微镜下观察荧光表达情况,用荧光分析软件Image J进行荧光强度分析并记录荧光强度,进而应用SPSS19.0软件对各转染荧光表达情况进行分析,确定loxp序列的位置对基因表达的影响。为了对以egfp基因为试验基因所得到的结果进行进一步验证,本试验选择植酸酶（phytase基因）基因为试验基因,egfp基因为转染内参基因萤火虫荧光素酶基因（luciferase基因）为表达内参基因。以pIREsNEo、pGEM-5zf-loxp和pT-phytase、pGL4.13[luc2/SV40]质粒为基础。构建了p-SV40-luciferase-CMV-loxp-phytase（loxp序列位于phytase基因开放阅读框的Kozak序列上游的5′非翻译区）、p-SV40-luciferase-CMV-loxp-phytase-loxp（phytase基因开放阅读框的Kozak序列上游5′非翻译区和终止密码子下游3′非翻译区各有一个loxp序列）、p-SV40-luciferase-CMV-phytase-loxp（loxp序列位于phytase基因开放阅读框的终止密码子下游的3′非翻译区）和p-SV40-luciferase-CMV-phytase（phytase基因开放阅读框的上下游均无loxp序列）等试验质粒,以egfp基因(pEGFP-N2)为转染内参基因与所构建的各种phytase基因表达结构共转染PK15细胞,同时设置一个转pEGFP-N2+ pDsRed2-N1的空白对照。转染48h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白基因表达情况,用荧光分析软件Image J进行荧光强度分析并记录荧光强度,应用SPSS19.0软件对各转染绿色荧光表达情况进行分析。同时应用钼蓝法测定各转染的植酸酶活性。应用萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒检测各转染萤火虫荧光素酶活性。用SPSS19.0软件对各转染的植酸酶和萤火虫荧光素酶表达水平（活性）进行统计分析。【结果】试验中以dsred2为内参基因,对转染后每个转染的不同区域红色荧光强度平均值(代表各转染红色荧光蛋白的表达水平)进行统计分析表明egfp基因各结构每个转染的间红色荧光蛋白表达水平差异不显著,表明不同转染间排除了转染操作、质粒纯度、细胞活性等的差异对分析结果的影响,转染前质粒的电泳结果表明,各质粒间不同构象的质粒比例基本一致,这也基本排除了转染用质粒质量的差异对转染效果的影响,对各转染不同区域绿色荧光强度的平均值（代表各转染的egfp基因表达水平）进行的统计分析表明,同一结构不同转染间egfp基因表达水平差异不显著,不同结构的转染间存在差异,其中ploxp-EGFP和ploxp-EGFP-loxp结构转染中绿色荧光蛋白的表达水平显著低于pEGFP-loxp和pEGFP-N2,而pEGFP-loxp和pEGFP-N2转染间egfp基因间的表达差异不显著。这一结果初步说明loxp序列在外源基因开放阅读框下游时对基因表达水平没有影响,在外源基因开放阅读框上游时对基因表达呈负影响,为了进一步验证上述结果的可靠性,本研究以植酸酶基因作为另一试验基因,以萤火虫荧光素酶基因为表达内参基因,以egfp基因为转染内参基因再次进行了验证,验证试验得到了相似的结果。【结论】开展通过基因打靶技术将外源基因与内源基因通过2A序列连接,实现外源基因和内源基因共表达的转基因动物制作研究中,以Cre/loxp系统作为报告基因删除工具时,则内源基因的下游为最佳的打靶位点。     

微卫星标记预测太行鸡与其他高产商品蛋鸡亲本间的杂种优势

为了给太行鸡的杂交改良提供参考依据,试验首先选取10个多态性微卫星标记座位,对太行鸡、海兰灰父系、海兰灰母系、罗曼粉父系、罗曼粉母系、京粉1号父系、京粉1号母系7个群体进行遗传多样性分析,计算群体遗传杂合度(He)、多态性信息含量(PIC)、不同品种的有效等位基因数(E),然后计算群体间的Nei式遗传距离,进行系统聚类分析。结果表明:所选择的微卫星标记座位多态性丰富,10个微卫星标记座位的PIC值在0.584 2～0.657 5之间,有效等位基因数在5.27～5.75个之间,杂合度在0.414 0～0.657 9之间,说明所选的微卫星标记座位可靠;群体间Nei式遗传距离以及系统聚类分析结果得出太行鸡与罗曼粉父系遗传距离最大(0.340 7),其次是海兰灰母系,海兰灰父系与京粉1号父系遗传距离最近(0.056 6),据此推测太行鸡母系与罗曼粉父系、太行鸡父系与海兰灰母系间杂种优势较高。     

快慢羽太行绿壳蛋鸡生长发育规律及生长曲线拟合分析

为了解太行绿壳蛋鸡快慢羽及不同性别个体间生长发育规律的差异,本实验选取太行绿壳蛋鸡快羽公鸡33只,快羽母鸡36只,慢羽公鸡30只,慢羽母鸡31只,记录其0~133日龄体重、体尺,用SPSS23.0统计软件中的双变量相关分析对体重和体尺指标间的相关性进行分析,并通过Logistic、Gompertz和Von Bertalanffy模型对太行绿壳蛋鸡快慢羽公、母鸡的体重、胫长进行拟合。结果表明:快羽公鸡生长发育最为迅速,慢羽公鸡较为迅速,快羽母鸡次之,慢羽母鸡生长发育最为缓慢,太行绿壳蛋鸡体重与体尺有显著相关性。Gompertz是体重模拟最优模型,最高拟合度为0.992,Von Bertalanffy为胫长模拟最优模型,最高拟合度为0.997。     

一种简单高效稳定的高质量第X期鸡胚盘DNA提取方法的建立

为了建立快速高效稳定的高质量鸡胚盘DNA提取方法,试验通过收集第X期鸡胚胎,应用酚氯仿抽提法、微量组织DNA提取试剂盒法和优化的硅胶膜吸附法分别提取鸡胚DNA,所提DNA经0.8%的琼脂糖凝胶电泳初步检测,并经PCR进一步分析检验,对不同方法提取DNA的稳定性和质量进行评价。结果表明:微量组织DNA提取试剂盒法提取的基因组DNA比用酚氯仿抽提法提取DNA的方法具有更高的稳定性和更好的质量,而微量组织DNA提取试剂盒法与本试验建立的优化的硅胶膜吸附法提取的基因组DNA稳定性和质量相近,但本试验建立优化的硅胶膜吸附法,无需蛋白酶K消化胚盘组织,因而优化了步骤降低了成本。试验建立了一个简单高效稳定的高质量低成本的第X期鸡胚盘DNA提取方法,为后续的相关研究建立了一个有效的鸡受精蛋胚盘DNA提取方法。