应用SELDI-TOF-MS技术对患脂肪肝奶牛血浆差异蛋白的分离鉴定及生物学分析

【目的】脂肪肝是围产期奶牛主要代谢性疾病之一,50%产后奶牛受其影响。产后奶牛生产力降低、繁殖性能低下、免疫功能减弱、肝功能衰竭和过早死亡都与脂肪肝有关。表面增强激光解析/电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）是一种对生物样本蛋白质研究的新型高敏感性蛋白质组学方法,文章旨在探讨脂肪肝奶牛血浆蛋白质组学特征。【方法】于黑龙江某集约化养牛场选择产后7-28d,1-2胎次荷斯坦奶牛40头。清晨空腹尾静脉采血10mL,应用肝素抗凝（150U）迅速离心（3 000 r/min,5 min）分离血浆,置于-80℃冰箱冷冻保存。依据血浆甘油三酯（TG＞0.20 mmol·L^-1）, 血浆β-羟丁酸（BHBA＞1.2mmol·L^-1）浓度和临床症状,将其分为试验组（T）20头和健康对照组（C）20头。应用SELDI-TOF-MS技术测得血浆蛋白质谱,利用Ciphergen Protein Chip Software (Version 3.1.1)对在试验组和对照组所有样品中得到的峰图进行分析,得到原始数据。将两组之间的数据峰值做wilcoxon sum rank test统计检验,用计算出的P值判断峰在两组中是否有显著差异。以0.01作为P值的阈值,筛选出P值小于0.01的差异峰。在得到的差异峰中,将差异峰的m/z值与Swissport蛋白数据库中多肽的理论荷质比 (mass to charge ratio,m/z)进行比较,找到最相似的蛋白作为差异峰可能检测蛋白的预测结果。【结果】与对照组相比,试验组奶牛血浆蛋白质谱存在39个差异峰,在得到的39个差异峰中,将差异峰的m/z值与Swissport蛋白数据库中多肽的理论荷质比值进行比较,最终获得26个可预测的差异峰,预测蛋白11种。结果显示,相对于C组,11种预测蛋白在T组中均表达下调。通过生物信息学（Network,GO,Pathway）分析,应用Cytoscape软件对获得的11种蛋白进行牛类基因网络搜索,得到Networks分析结果图。在数据库中搜索到了试验结果中的淀粉样肽前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)和纤维蛋白原α链(fibrinogen alpha chain, FGA)两种差异蛋白,并得到其相关的Networks分析结果。应用Cytoscape软件中BinGO插件对11种蛋白进行GO分析,并得到GO分析结果。对这些蛋白质经软件搜库得到已经注释的差异蛋白有9种,分别为FGA、血清淀粉样蛋白A (serum amyloid A protein, SAA)、血浆蛋白酶c1抑制剂（plasma protease c1 inhibitor, SERPING1 or C1INH）、血清载脂蛋白-CⅢ（apolipoprotein c-Ⅲ,ApoCⅢ）、海帕西啶（hepcidin, HAMP）、骨桥蛋白（osteopontin, OPN or SPP1）、 甲状腺素运转蛋白（transthyretin, TTR）、胱蛋白酶抑制剂C （cystatin-c, CysC or CST）、神经分泌血管生长因子蛋白（neurosecretory protein, VGF）。应用KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）pathway数据库搜索。搜索结果显示只有6种蛋白质可在数据库中搜到,分别是FGA、SERPING1、APO-CⅢ、APP、CysC、SPP1。并得到其相关的Pathway分析结果。这些蛋白可能是与奶牛脂肪肝发病机制相关的物质。【结论】应用SELDI-TOF-MS技术有效的分离了健康牛与患病牛之间的血浆差异表达蛋白,均在肝脏代谢或脂肪肝疾病发生发展过程中起重要的调节作用,对探究奶牛脂肪肝发病机理及其对机体生物学功能的影响具有重要的理论价值。差异蛋白对奶牛脂肪肝的发病机理的影响尚待进一步研究。     

亚临床型低血钙症奶牛生产性能及粪污排放特性

【目的】探讨亚临床低血钙症奶牛饲料采食量、泌乳量、粪尿排放量及粪污所产生污染气体排放特征的关系。【方法】黑龙江某集约化奶牛养殖场选取产后7—14 d年龄、体况、胎次相近的奶牛12头,根据血钙指标分为亚临床低血钙症组和健康组奶牛各6头,每头奶牛分别单独饲养,连续饲养4 d。每天采血检测血液中Ca、BHBA、NEFA、CLU、P、Mg指标含量;记录每头牛每天泌乳量、采食量、粪、尿排放量;通过简易动态箱法对试验奶牛粪尿进行混合,检测混合物产生的NH_3、CO_2、CH_4气体排放量并进行分析。【结果】亚临床低血钙症组奶牛血清Ca、P、Mg浓度极显著低于健康组奶牛(P0.01),CLU显著低于健康组(P0.05),BHBA浓度显著高于健康组(P0.05),NEFA浓度极显著高于健康组奶牛(P0.01);亚临床低血钙症组奶牛产奶量和4%能量校正乳(ECM)极显著高于健康组(P0.01),排粪量显著高于健康组(P0.05);干物质消化率和尿量的差异虽然不显著但都有升高趋势。亚临床低血钙组奶牛采食1 kg干物质的产奶量极显著升高(P0.01),采食1 kg干物质的排粪量显著升高(P0.05);健康组和亚临床低血钙症组奶牛CH4的排放曲线无明显差异,两组的产气趋势基本相同,于试验的52 h左右出现峰值,之后下降;总体上看CO_2的排放没有明显变化趋势,无明显规律,健康组和亚临床低血钙症组分别在48和36 h处出现排放高峰,亚临床低血钙症组出现峰值的时间要早于健康组,之后下降随即无规律起伏。亚临床低血钙症组的CO_2累计排放量随时间的推移低于健康组;健康组奶牛NH_3排放浓度在24h处出现高峰,随后降低,45 h再次出现峰值,之后排放浓度逐渐降低。亚临床低血钙症组奶牛NH_3排放浓度在21 h处出现峰值,之后排放浓度降低,两组试验的折线趋势基本一致,都是出现峰值后浓度降低但都是有起伏的波动。亚临床低血钙症组NH_3的累计排放量低于健康组。【结论】亚临床低血钙症奶牛患病期间由于采食摄取营养物质不能满足泌乳需求而处于能量及钙负平衡状态。同时肠道消化吸收率增加,用于满足泌乳对能量的需求;在相同质量的粪尿混合物检测情况下亚临床低血钙症不会影响CH_4的排放量,但亚临床低血钙奶牛粪尿中NH3和CO_2排放量低于健康牛,然而降低的温室气体排放是否与肠道消化吸收率的增加促进了饲料能量的吸收有关利用仍需进一步研究。     

黑龙江省放牧与舍饲肉牛肝功能状态的评价

为了比较舍饲和放牧两种饲养模式肉牛肝功能的状态,试验选择黑龙江省双鸭山、九三、大庆3个地区的肉牛养殖场共59头肉牛,分别于6,7,8月份定期采集血液,分离血清检测7项肝功能指标和5项能量代谢指标。结果表明:3个地区放牧组总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)、总胆红素(TBIL)含量和丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、谷氨酰转肽酶(GGT)活性与舍饲组差异不显著(P0.05),但放牧组ALT、AST、GGT活性和GLO含量高于舍饲组;大庆地区舍饲组肉牛葡萄糖(GLU)含量极显著高于放牧组(P0.01),九三地区舍饲组肉牛GLU含量显著高于放牧组(P0.05)。说明舍饲组和放牧组肉牛肝功指标存在差异,且舍饲组肉牛肝功能状态要优于放牧组。     

乳脂球膜蛋白的研究进展

乳脂球膜蛋白是乳腺在泌乳时包被在脂肪滴外的膜蛋白。乳脂肪球膜（milk fat globule membrane,MFGM）是磷脂、鞘脂和多种蛋白质组成的3层膜结构。乳脂球膜蛋白包含100余种蛋白质,含量最丰富的8种蛋白质为黏液素1、黄嘌呤氧化还原酶、黏液素15、CD36、嗜乳脂蛋白、乳凝集素、脂肪分化相关蛋白和脂肪酸结合蛋白。乳脂球膜蛋白已被证明具有丰富的开发利用价值,包括：反映奶牛母体的生理状态;作为幼体的营养和免疫来源,会影响犊牛的发育和母源抗体;会影响人和动物的免疫调节和体质,未来可能应用于疾病的治疗。作者介绍了乳脂球膜蛋白的来源、组成及一种新建立的乳脂球膜蛋白结构,阐述了几个主要蛋白的生理特性及乳脂球膜蛋白的研究进展,并对未来的研究方向提出建议。     

酮粉法和血酮仪诊断奶牛酮病的效果评价

评价酮粉法和血酮仪法诊断奶牛酮病的性能。于某集约化牛场选取1~6胎次,产后7~21 d泌乳奶牛291头,分别用血酮仪检测血液β-羟丁酸含量和酮粉法检测乳液,诊断奶牛酮病。结果表明:血酮仪法具有检测准确,检测率高,但费用较高,易受环境因素影响等特点,不适合集约化牛场大批量使用。酮粉法具有样品采集简便,价格低廉,且具有较理想的检测灵敏度等特点,适合奶牛群体酮病筛查诊断。酮粉法更适合大型牧场泌乳初期奶牛酮病的群体检测,血酮仪可用于对疑似牛的确诊性检测。     

加快长江流域水土保持步伐为西部开发创造良好环境

水土保持是生态环境建设的主体 ,搞好水土保持是实现西部经济、社会可持续发展的基础。生态环境建设和西部大开发要求长江流域加大退耕还林还草力度 ,依法防治人为水土流失 ,全面加强水土保持监督执法工作。全社会、多部门参与水土保持 ,水土保持部门应做好行业归口管理。要继续加大水土保持宣传 ,建好示范工程 ,建好水土保持监测网络 ,为全面开展监测打下基础。     

依法防治水土流失 促进长江流域可持续发展

水土保持法颁布实施 10年来 ,以“长治”工程为骨干的长江流域水土流失重点治理快速推进。截至 2 0 0 0年底 ,累计完成水土流失初步治理面积 2 1万km2 ,其中“长江”工程 12年初步治理水土流失面积 6 8万km2 ;水土保持监督执法不断加强 ,建立了一支有 70 0 0名专职监督人员的执法队伍 ,初步建立健全了贯彻实施水土保持法的配套法规体系 ,累计对 6 80 0多起开发建设项目造成的人为水土流失违法案件进行了立案查处 ,审批水土保持方案超过 4 1万个 ,开发建设单位交纳水土流失防治费 35 0 0多万元 ,补偿费 370 0多万元 ,自行投入水土流失防治费累计超过 6 7亿元 ,取得了许多值得推广的好经验。     

全面推进新世纪的城市水土保持工作

随着城市化步伐加快 ,城市水土流失问题日益突出。自然流失是城市水土流失的次要方面 ,城市建设产生的人为水土流失是城市水土流失的主体。优美的生态环境是现代化文明城市的重要标志。提高各级领导的认识是搞好此项工作的关键因素。推进城市水保工作的具体措施是进一步强化领导 ,搞好规划 ,广泛宣传 ,继续搞好示范建设工作。