鸡柔嫩艾美耳球虫2种假定致密颗粒蛋白基因的克隆与表达

柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)是一种严重危害养鸡业健康发展的高致病性原虫,致密颗粒蛋白(dense granule proteins, GRAs)是顶复合器门原虫胞内寄生重要功能蛋白,具有较高的免疫学应用价值,然而目前尚未有关于球虫致密颗粒蛋白的确切报道。为发掘柔嫩艾美耳球虫GRAs并研究其功能,采用生物信息学、分子生物学、免疫学等技术从E.tenella北京株中鉴定到2种假定致密颗粒蛋白(hypothetical dense granule protein, hEtGRA)hEtGRA12、hEtGRA9,并用纯化后的蛋白分别免疫小鼠制备多克隆抗体,用ELISA、Western blot方法检测2种蛋白的抗原性。分子克隆结果表明,hEtGRA12、hEtGRA9基因编码区长度分别为1 188、1 110 bp,分别编码395、369个氨基酸,与其他顶复合器门原虫致密颗粒蛋白GRA12、GRA9物种间相似性分别为28.8%～39.6%、27.5%～29.5%;SDS-PAGE结果显示,重组蛋白rhEtGRA12、rhEtGRA9条带大小分别为63.6、67.0 ku;...     

柴油机维修应注意的几个问题

<正>一、柴油雾化问题柱塞副、出油阀副及喷油器针阀副的状态不好,都可能造成喷油雾化不良,使柴油机启动困难,燃烧不完全,积炭增多,以致发动机功率下降,油耗增加,因此,对燃油系,特别是精密偶件要进行认真检查。二、小孔与通孔问题1.小孔(1)油箱盖通气孔:该孔堵塞后,油箱不再与大气相通,油箱上部因油面下降会出现负压,造成供油中断;燃油受热后蒸发,使油箱内压力升高,引起油箱漏油。(2)曲轴箱换气孔:换气孔堵塞后,曲轴箱内废气越积     

拖拉机变速箱及后桥故障的诊断与排除

<正>一、齿轮磨损快速测定方法。这里向你介绍一种我国某大学研制成功的测定齿轮磨损的检测圆盘,可确定齿轮磨损的程度。检测时只需将副变速轴的链轮轴盖打开,并用拆下的两颗螺钉将检测圆盘固定住,再将一带有磁性的小指针放在副变速轴芯上,则指针随副变速轴旋转。测量时,将驱动轮的前后用石块塞住,以提高检测精度。选择好挡位,顺向转动皮带轮将各啮合齿轮副的间隙消除,此时,将指针对准圆盘上"0"点,然后,反方向转动皮带轮,直到转动困难(消     

微小隐孢子虫黏蛋白CGD5_2060原核表达及其黏附功能

从微小隐孢子虫c DNA中克隆黏蛋白cgd5_2060基因,并对其蛋白功能相关基序进行预测;构建原核表达载体p ET32a-cgd5_2060,转化至大肠埃希菌Rosetta中,诱导表达并纯化重组蛋白CGD5_2060,制备鼠源多克隆抗体,并通过间接酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法测定其抗体效价;将纯化的重组蛋白CGD5_2060及载体对照蛋白与Caco2细胞共孵育,通过蛋白质印迹法(Western blotting)与间接ELISA方法检测其细胞黏附特性。结果表明,CGD5_2060蛋白的1~19个氨基酸为信号肽,说明该蛋白是分泌型蛋白。使用PROSITE数据库分析发现:该蛋白含有1个富含苏氨酸的区域TTTTTTKSTTTTTTAVTT,位于510~527个氨基酸处;此外,还有1个与细胞黏附有关的序列RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸),位于69~71个氨基酸处。上述结果表明,cgd5_2060基因可能与微小隐孢子虫黏附宿主细胞相关。原核表达的重组蛋白CGD5_2060具有良好的免疫原性,获得了较高效价的多克隆抗体。重组蛋白与Caco2细胞共孵育,通过蛋白质印迹法与间接ELISA方法检测发现,CGD5_2060可以与Caco2细胞黏附。本试验为揭示微小隐孢子虫黏附细胞的机制提供了一定的理论基础。     

弓形虫环核苷酸依赖性蛋白激酶真核表达载体构建及在Vero细胞内的定位分析

为研究弓形虫环核苷酸依赖性蛋白激酶(PKAR)基因在Vero细胞内的定位情况,本研究构建弓形虫TgPKAR-RFP-C2真核表达质粒,并将其真核转染至Vero细胞内。试验中利用PKAR基因序列设计引物,以反转录获得的cDNA模板进行PCR扩增,成功获得目的片段,并构建克隆质粒pMD-PKAR。经BglⅡ和HindⅢ双酶切后构建真核表达质粒PKAR-RFP-C2,利用脂质体转染法将其导至Vero细胞内,利用Leica激光共聚焦显微镜观察PKAR基因在Vero细胞内的表达情况及其定位。结果显示,成功获得了PKAR基因,与GenBank公布的基因序列相似性为100%,并成功构建真核表达质粒及在Vero细胞内表达。Western blot试验成功检测到目的条带;激光共聚焦显微镜观察发现PKAR基因主要在Vero细胞的细胞质中呈点状表达。结果为进一步研究PKAR基因生物学功能及核酸疫苗研制奠定基础。     

弓形虫能量代谢及营养物质的来源概述

弓形虫病是由弓形虫感染引起的严重人兽共患寄生虫病,对人类健康及畜牧业发展造成巨大威胁.弓形虫通过独特的代谢途径从宿主细胞获得营养物质进而满足其在细胞内增殖及存活.虫体自身的糖酵解及三羧酸循环途径对于其正常生长至关重要,糖酵解关键酶被抑制可促进缓殖子的形成,明确糖酵解及营养物质存储在缓殖子阶段的作用,将有助于揭示包囊形成...     

基于重组截短蛋白mp-tGAPDH的微小支原体抗体间接ELISA检测方法建立和应用

猪源嗜血支原体(Hemotropic mycoplasma,HM)寄生于猪红细胞表面及骨髓中,引起猪传染性贫血,给我国养猪产业造成危害。近年来病原流行病学调查发现我国流行三种HM,猪支原体(Mycoplasma suis,M. suis 猪附红细胞体),微小支原体(M. parvum)和新种Candidate Mycoplasma hemosuis(CMh)。且M. parvum在是我国浙江和海南猪群中的主要流行嗜血支原体,目前仅M. suis有血清抗体检测方法报道。本研究根据M. parvum ZJ9330株的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因序列设计引物扩增404 bp的部分基因片段、原核表达纯化15 ku截短蛋白mp-tGAPDH,Western-blot表明纯化蛋白mp-tGAPDH与小鼠抗mp-tGAPDH血清有较好的反应性。以mp-tGAPDH为包被抗原,建立了检测M. parvum抗体的间接ELISA方法。特异性实验表明,建立的ELISA方法不与猪圆环病毒病、猪瘟、伪狂犬病、猪繁殖与呼吸综合征和弓形虫阳性血清交叉反应。重复性实验表明,该ELISA方法批间和批内重复性低于18.4%,表明该法有较好的重复性。用建立的ELISA方法对浙江省上虞地区5个猪场248份临床送检血清进行了检测, M. parvum血清抗体阳性率为36.69% (91/248)。本研究建立的间接ELISA方法为猪微小支原体的检测和流行病学调查提供了一种快速简便的血清学诊断方法。     

玉米秸秆还田及施磷量对黑土磷吸附与解吸特性的影响

以探究松嫩平原玉米连作条件下,秸秆还田与施磷量互作对黑土磷吸附与解吸特性的影响为目的。该试验采取二因素裂区试验设计,主因素为玉米秸秆还田方式,分别为秸秆不还田(S0)、秸秆翻埋还田(S1)和秸秆焚烧还田(S2);副因素为施磷水平,分别为0(P0)、34.50(P1)、69(P2)、103.50(P3)kg/hm~2(P_2O_5)。结果表明:1)Langmuir等温吸附方程最适合拟合黑土对磷的吸附特征。2)秸秆还田与施磷量均显著影响黑土对磷的吸附与解吸特性,且两者互作效应显著。在相同秸秆还田方式下,随着施磷量的增加,土壤对磷的吸附能力均逐渐降低,而土壤中磷的解吸量和解吸率均逐渐增加,其中以S0条件下差异最大,S2条件下次之,S1条件下差异最小。在相同施磷水平下,与S0处理相比,S1和S2均能降低土壤对磷的吸附能力,增加土壤中磷的解吸量和解吸率,其中以不施磷肥(P0)处理下差异最大,而在施高磷(P3)处理下差异不显著,此外,S1与S2在各施磷水平下差异均不显著。3)不同施磷处理下的标准需磷量(standardPrequirement,SPR)为71.02～91.67 kg/hm~2,其中以S1P2处理的SPR(73.58 kg/hm~2)与P2施磷水平(69 kg/hm~2)最相近,是松嫩平原黑土区较为适宜的施磷方式。     

杭州市规模化养殖场湖羊芽囊原虫的PCR检测与基因亚型鉴定

[目的]掌握杭州市规模化养殖场中湖羊芽囊原虫的感染情况和基因亚型分布。[方法]从杭州市4个规模化养殖场采集167份湖羊的新鲜粪便样本,提取粪便全基因组DNA;基于小亚基核糖体RNA(SSU rRNA)基因,对粪便DNA样本进行PCR扩增,对阳性产物进行测序;经序列比对鉴定芽囊原虫基因亚型,构建系统进化树解析其遗传进化关系。[结果]167份样本中,检测出芽囊原虫阳性样本18份,感染率为10.78%(18/167);3个养殖场呈芽囊原虫阳性,感染率依次为21.43%(3/14)、21.21%(14/66)和2.13%(1/47),1个养殖场未检测出芽囊原虫;不同养殖场之间湖羊芽囊原虫的感染率存在极显著（P<0.01）差异。鉴定出7个芽囊原虫基因亚型,分别为ST7(n=1)、ST10(n=9)、ST21(n=3)、ST23(n=1)、ST24(n=2)、ST26(n=1)、ST30(n=1),以ST10亚型为优势感染亚型（9/18,50.00%）;基于芽囊原虫SSU rRNA基因的系统进化树分析发现,6种基因亚型序列聚类形成1个大群,其中ST10和ST23聚类形成亚群,ST21、ST2...