野生稻基因组抗性基因富集文库的构建

通过集成候选抗性基因克隆技术和磁珠富集文库技术以及可转化基因组文库技术,提出了基于野生稻基因组富集文库克隆野生稻新抗性基因的策略。包括构建野生稻可转化基因组文库,利用RecA重组蛋白介导生物素标记的探针对文库进行磁珠富集,构建野生稻基因富集文库,然后对富集文库的克隆进行鉴定分析,包括点杂交和克隆末端测序分析,最后对富集文库的阳性克隆进行全序列测定和功能验证。按照上述方法,构建了东乡普通野生稻和小粒野生稻可转化基因组文库,库容量分别达到1.58×105和2.68×105个克隆,进而构建了东乡野生稻基因组候选抗性基因富集文库,单克隆总数1 152个,对富集文库的菌落原位杂交筛选获得12个阳性克隆,对其中5个阳性克隆全序列测定结果表明,4个阳性克隆含有已克隆抗性基因的保守序列,证实构建候选抗性基因富集文库克隆野生稻新抗性基因的策略是可行的。     

β-甘露聚糖酶基因克隆与在大肠杆菌中表达

为了通过基因工程方法在大肠杆菌中发酵生产β-甘露聚糖酶,采用多重比较几种来源的β-甘露聚糖酶氨基酸序列,获得了该酶的保守结构域,并按此设计简并引物．以能水解魔芋葡甘聚糖的枯草杆菌属野生筛选菌种A33为材料,通过简并引物PCR法从A33基因组中扩增出β-甘露聚糖酶基因核心区段．经过克隆、测序及BLASTN比对分析,证实该DNA区段推导的编码蛋白具有β-甘露聚糖酶的保守结构域,属于该酶家族中的一员．将该片段构建到大肠杆菌表达载体pRsET-A并转入大肠杆菌表达系统BL21 DE3（pLysS）,经过诱导获得了此酶的高效表达．     

苎麻纤维素合成酶基因cDNA的克隆及表达分析

以苎麻 [Boehmeria nivea (Linn.) Gaud.] 栽培种湘苎3号为材料, 通过简并引物RT-PCR结合RACE技术首次成功克隆苎麻纤维素合成酶基因BnCesA1 5′端450 bp序列以外的全部cDNA 序列, 序列长3 276 bp, 编码一段938个氨基酸的蛋白质。经基因比对及蛋白质结构分析确证是苎麻纤维素合成酶基因。半定量RT-PCR分析显示：BnCesA1在苎麻根、茎、叶和芽组织中均有表达, 其表达量为茎＞叶＞芽＞根, 相对表达量依次为 0.791、0.381、0.319和0.183。从其表达模式可以推测该基因同时参与了苎麻细胞初生和次生细胞壁纤维素的合成。     

黄孢原毛平革菌木质素过氧化物酶基因的克隆和序列分析

以黄孢原毛平革菌基因组DNA为模板,克隆Lip-2基因片段,结合序列测定和生物信息学方法对扩增序列进行分析,结果证实所获得的序列与GenBank中已经登陆的Lip-H8基因具有高度的同源性,其N-端也具有真核生物分泌型信号肽序列.Lip-2基因序列的获得为下一步将其构建到酵母表达载体中进行蛋白质表达奠定了基础.     

苎麻纤维素合成酶基因cDNA的功能分析

运用克隆的苎麻纤维素合成酶(BnCesA1)基因cDNA及植物表达载体pWM101,构建了35S启动子控制的苎麻BnCesA1基因核心区段反义融合表达载体(pWM-BnCesA),并通过根癌农杆菌介导法将其转化至模式烟草WS38,获得了转基因烟草.对转基因烟草植株进行的分子检测和初步组织学研究表明,转反义BnCesA1基因核心区段对纤维素的合成产生干扰,植株叶柄切片初生组织细胞较野生烟草松散,其基本组织细胞涨大,间隙也相应增大,证实BnCesA1基因的纤维素合成功能,表明BnCesA1基因在植物初生组织和次生组织的细胞壁合成中都发挥作用.     

三种野生稻候选抗病基因的克隆与分析

候选抗性基因克隆策略是克隆植物新抗性基因的重要途径.根据已知NBS-LRR类抗病基因结构中的氨基酸保守区域,设计兼并引物,通过RT-PCR扩增、克隆和测序,从茶陵野生稻,东乡野生稻和小粒野生稻中共获得了11条NBS-LRR类抗病基因同源序列.通过聚类分析可将同源序列分为3类,其中茶陵野生稻中得到1类,东乡野生稻中得到2类,而小粒野生稻中得到3类.但是小粒野生稻包含有其他两种野生稻的序列.三类序列都与水稻抗病基因RPR1具有较高的同源性,有一类氨基酸序列同源性甚至高达88%,可能为其家族成员.利用电子定位将三类序列定位在水稻基因组11号染色体上RPR1附近.根据序列比对分析结果认为其中可能有1～2个新抗病基因.