甜菊葡萄糖苷转移酶基因SrUGT76G1启动子的克隆及其功能的瞬时表达分析

甜菊苷(stevioside,St)和莱鲍迪苷A(rebaudioside A,R-A)是甜菊叶片中两大主要糖苷组分,甜菊糖苷生物合成途径的研究表明SrUGT76G1基因在St向R-A转化中起关键作用。为了进一步研究SrUGT76G1基因的表达调控,本试验采用hiTAIL-PCR的方法,经过2次步移从甜菊基因组中克隆到SrUGT76G1基因翻译起始位点上游2 283 bp的启动子序列。采用PlantCARE、PLACE等在线工具对序列进行分析,结果显示在这段序列上共有475个顺式调控元件,除了TATA-box、CAAT-box、MYB结合位点等典型的保守元件外,还包括光照、干旱、厌氧等环境因子响应元件,生长素、赤霉素等植物激素响应元件,芽、胚乳等组织特异性表达元件等。为了初步研究SrUGT76G1基因启动子的功能,本试验通过克隆SrUGT76G1转录起始位点上游1 989 bp带酶切位点的序列,将其替换植物表达载体pCAMBIA1301-220中的CaMV35S启动子,连接下游的GUS报告基因,构建重组植物表达载体pCAMBIA1301-220-SrUGT76G1P,以pCAMBIA1301-220载体作对照,通过农杆菌(EHA105)真空渗透法转入拟南芥和甜菊幼苗。瞬时表达结果表明,该SrUGT76G1启动子序列能驱动GUS基因在拟南芥和甜菊叶片中表达,具有启动子活性。     

微量元素配施对甜菊生长和甜菊糖苷含量的影响

采用正交试验设计,以当年生甜菊扦插苗为试材进行盆栽试验,研究锌(Zn)、硼(B)、锰(Mn)、钼(Mo)配施对幼苗生长和糖苷含量的影响。结果表明,合理配施Zn、B、Mn、Mo能促进甜菊生长发育,施锌能显著影响甜菊茎粗,施钼则显著影响甜菊叶片中叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量;适宜配比的Zn、B、Mn、Mo对甜菊糖苷含量也有积极的调节作用,Zn 0.1%、B 0.1%、Mn 0.3%和Mo 0%的组合处理下甜菊叶片中R-A苷和总甜菊糖苷含量均最高,Zn 0.2%、B 0%、Mn 0.2%和Mo 0.3%的组合处理使甜菊叶片中R-A/总苷的比率最高。     

甜菊单倍体的离体诱导初探

对甜菊头状花序、花及小孢子的发育进行了观察,在此基础上分离了甜菊花药和未受精胚珠,并分别进行体外培养诱导单倍体。结果表明甜菊花药诱导愈伤较容易,在MS+1.5 mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+4%蔗糖的培养基上诱导愈伤率高达80%,由于尚未得到胚状体或再生植株,花药愈伤继续诱导分化还需进一步研究;通过培养基筛选发现未受精胚珠在MS+0.04 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA+4%蔗糖的培养基上可直接诱导出胚状体,诱导率为1.2%,本试验共诱导出胚状体4个,转接生根并移栽存活2株,但经根尖细胞染色体计数发现其均为二倍体(2n=22),因为两再生植株现蕾期、株高、叶型等性状与亲本有显著差异,推测其可能是单倍体自然加倍的结果,但有待进一步研究证明。本研究作为甜菊单倍体诱导培养的初次尝试,对今后甜菊育种和遗传研究有重要意义。     

甜菊叶片β-葡萄糖苷酶的提取及其性质研究

为研究β-葡萄糖苷酶在甜菊糖苷降解代谢中的作用,并为今后通过抑制甜菊糖苷的降解从而提高其含量的育种工作等奠定理论基础。本研究以甜菊为试验材料,首先对甜菊叶片β-葡萄糖苷酶的提取及酶活性测定方法进行了优化,并进一步对该酶性质进行了初步分析。结果表明,以pH 7.0的50 mmol/L磷酸缓冲液提取,研磨时添加等量PVP,粗酶液经20%~40%饱和度硫酸铵进行盐析的酶液其酶活性最高;以pNPG为底物测定其酶活性时37℃孵育60 min最佳。酶性质分析结果表明,该酶具有较高的热稳定性和pH值稳定性,其最适温度为30℃,最适pH 7.0;4℃保存时酶活性逐渐降低,至26天时酶活力仅余26.4%;在9种常见金属离子中Mn ²⁺、Fe ²⁺对该酶有显著的激活作用,而Cu ²⁺、Hg ²⁺对该酶的抑制作用较明显。     

甜菊β-葡萄糖苷酶活性与甜菊糖苷含量变化的研究

为了研究甜菊β-葡萄糖苷酶在甜菊糖苷降解代谢中的作用,分别采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,简称HPLC)和分光光度计法对甜菊糖苷含量和β-葡萄糖苷酶活性进行同步检测分析。结果表明,不同甜菊品种中具有高甜菊苷(stevioside,简称St)含量的中山5号、大叶1号具有较高的β-葡萄糖苷酶活性;在中山5号开花期植株的不同器官中,β-葡萄糖苷酶活性与甜菊糖苷含量的变化趋势较一致,其中叶片中的β-葡萄糖苷酶活性、甜菊糖苷含量均最高,花中次之,茎中较低,根中均最低;中山5号3个主要生长时期叶片中的β-葡萄糖苷酶活性随生长发育的推进而逐渐升高,其甜菊糖苷含量则随生长发育的推进先升后降,现蕾期最高。研究结果可为后续甜菊β-葡萄糖苷酶及其基因的研究奠定基础。     

一个棉花液泡转化酶基因的克隆与功能分析

棉纤维正常发育需要大量的蔗糖供应。转化酶是生物体内蔗糖代谢途径中的关键酶之一, 对转化酶基因的结构和功能研究将有助于揭示复杂的棉纤维发育分子机制, 并为纤维品质改良提供优良的基因资源。本研究以棉纤维突变体im和遗传标准系TM-1纤维发育中显著差异表达的EST序列(GenBank登录号为EY196825)为探针, 通过电子克隆方法, 结合cDNA及基因组全长基因PCR扩增、测序验证, 克隆到一个棉花液泡转化酶基因GhVacInv2a (GenBank登录号为KF305322)。该基因ORF全长1857 bp, 编码618个氨基酸, 与已登录的陆地棉GhVacInv2基因(GenBank登录号为FJ864677)序列一致性为99%(E=0)。基因组序列分析表明, GhVacInv2a在二倍体棉种非洲棉和雷蒙德氏棉中含1个拷贝, 在四倍体陆地棉和海岛棉中存在2个拷贝, 其中GhVacInv2a和GhVacInv2分属于A、D亚组同源基因。该同源基因含7个外显子, 6个内含子。Q-PCR分析表明, 该基因在花药中表达量最高, 在快速伸长的纤维组织中优势表达。在13~19 DPA的纤维中, 其在TM-1中的表达水平极显著地高于im突变体。开发SNP标记, 将GhVacInv2a基因定位在异源四倍体棉花第3染色体上。标记与性状的关联分析显示, GhVacInv2a与纤维强度存在显著相关(P=0.0087), 表明GhVacInv2a在棉花纤维品质形成中可能发挥重要功能。