泡桐丛枝植原体胸苷酸激酶的原核表达、纯化及酶活性测定

胸苷酸激酶是d TTP从头合成和补救途径的关键酶,催化d TMP形成d TDP,在DNA复制和生物的生存中发挥着必不可少的作用。本文在前期研究的基础上,对从泡桐丛枝(Pa WB)植原体中获得的的3个同源蛋白TMK-a-1、TMK-a-2及TMK-b与已报道的小麦蓝矮(WBD)、洋葱黄化(OY-W)植原体的TMK-a、TMK-b的氨基酸序列进行了比对和相似性分析,结果显示Pa WBPS TMK-b与WBD TMK-2和OY-W TMK-b之间的相似性分别为95.65%和99.03%;Pa WBPS TMK-a-1与Pa WBPS TMK-a-2的相似性为90.57%,且二者与WBD TMK-1和OY-W TMK-a之间的相似性为87.32%-94.26%;而Pa WBPS、WBD、OY-W三种植原体的TMK-a与TMK-b之间的相似性仅为22.22%-25.95%。构建了Pa WBPS TMK-b、TMK-a-1、TMK-a-2的p ET28a原核表达载体,对Pa WBPS TMK-b、TMK-a-1、TMK-a-2 3种蛋白进行了原核表达,经Ni-NTA柱纯化后,利用双酶法进行了胸苷酸激酶催化活性测定,结果表明,Pa WBPS TMK-b具有较高的胸苷酸激酶活性,为85.96±0.74 U·mg-1,而Pa WBPS TMK-a-1和TMK-a-2几乎没有胸苷酸激酶活性。本文为进一步研究胸苷酸激酶在植原体繁殖过程中的作用机理奠定了基础。     

泡桐丛枝植原体河北平山和江西吉安株系胸苷酸激酶基因多态性分析

设计引物并 PCR扩增河北平山株系 PaWBPs 和江西吉安株系 PaWBJan 的 tmk 基因,直接和克隆测定tmk序列,利用DNAMAN,MEGA等软件进行序列多样性、序列变异、蛋白功能域、系统进化等比较分析。结果表明：从 PaWBPs和 PaWBJan中克隆测序的93条和41条 tmk-a中,分别有52和24种不同的序列,tmk-a ORF 可被划分为2类,tmk-a-1为639 bp,tmk-a-2为627 bp,PaWBPs株系tmk-a-1与tmk-a-2序列条数的比值约为2.5,而PaWBJan株系为3.3; PaWBPs有5个相同的 tmk-a-1序列与 PaWBJan的一个 tmk-a-1序列及枣疯植原体 tmk-Y 序列完全一致。因多位点突变,PaWBPs含假基因比例达48.1%,PaWBJan的为41.7%; tmk-b基因为单一序列,两株系的 tmk-b核酸序列相似性为99.8%,编码蛋白仅有一个氨基酸差异。TMK-a和 TMK-b中都具有胸苷酸激酶的3个保守功能域。系统进化分析显示,泡桐丛枝植原体的2个株系的所有tmk-a序列都与枣疯植原体tmk-X和tmk-Y等聚为一个进化枝Ⅰ中;而tmk-b与小麦蓝矮tmk-2等聚为另一进化枝Ⅲ,基于tmk-b序列和基于16S rDNA序列构建的系统进化树一致,tmk-b有助于植原体16Sr组水平的分类,而 tmk-a可用于植原体株系变异和遗传多样性分析。     

加拿大进境燕麦种子中大豆北方茎溃疡病病菌的检疫鉴定

从来自加拿大的燕麦种子中分离到3株可疑真菌,经形态特征鉴定、分子生物学鉴定及致病性测定,确定截获的3株真菌均为大豆北方茎溃疡病病菌(Diaporthe phaseolorum var.caulivora)。这是我国口岸首次从进境的燕麦种子中截获该病菌。     

基于高通量测序及分离培养初步研究美国大豆中真菌多样性

中国是全球最大的大豆进口国,进境大豆所携带的病原真菌传入我国的风险极高.基于高通量测序技术对6批美国大豆真菌多样性进行分析,同时采用分离培养获得单一菌株,依据菌落形态、显微结构及分子技术进行鉴定.高通量测序结果显示,大豆中所有真菌共计5门15纲35目63科112属155种,主要为链格孢属(Alternaria)、球腔菌...     

4种植物病害植原体病原质粒全序列测定及分子特征

根据已发表植原体质粒序列设计引物,经2次PCR扩增,获得大小不同的2段DNA片段,测序后拼接得到4种完整的环状质粒,分别是桑树萎缩植原体濮阳株系质粒(pMDPy)、长春花绿变植原体海南株系质粒(pPeVHn)、泡桐丛枝植原体山东株系质粒(pPaWBG33D)及苦楝丛枝植原体福清株系质粒(pCWBFq-2),其中pMDPy为首次测定,其质粒全长分别为3 833,3 943,3 843和3 913 bp,4种质粒皆编码5种蛋白,ORF1和ORF5分别编码复制相关蛋白(RepA)和单链DNA结合蛋白(SSB),ORF2-4编码未知功能蛋白.4种质粒序列的非编码区分析表明,ORF1和ORF2之间的非编码区存在启动子和核糖体结合位点.将4种植原体质粒全序列与GenBank中登录的植原体质粒进行序列相似性比对和系统进化分析,结果表明这4种质粒与其他16Sr Ⅰ组的质粒聚为一个大的分支,与16S rDNA系统发育树基本一致.这可为进一步深入了解不同植原体质粒的结构与功能、寄主专化性和质粒基因变异及进化奠定基础,也可为基于多基因分类鉴定提供新的理论依据.     

我国部分枣树品种(系)的枣疯病抗性鉴定

收集了我国部分地区的不同枣树品种(系)的休眠期健康接穗材料,于2009年和2010年的4-6月嫁接到枣疯病砧木上,定期检查接穗发病状况,并采用PCR技术检测植原体感染.结果显示,不同枣树品种对枣疯病的抗性差异明显,根据接穗发病早晚、症状轻重、发病率和病情指数,将测定品种分为5个类型,其中高度抗病品系2个、中度抗病品系4个、一般抗病品系15个、感病品系7个、高度感病品系6个.高抗品系(交城骏枣、唐县和太原壶瓶枣)嫁接当年萌生枝条枣疯病无明显症状或嫁接早期无症状,后期症状较轻.嫁接到病树遮阴部位的接穗发病程度要重于向阳部位;存放期长和嫁接时间早的接穗,易诱发抗性品系发病.巢式PCR能检测到无症抗病接穗内低浓度植原体侵染.与以往所采用的昆虫自然传染和病皮或病枝嫁接到待鉴定的砧木品系上鉴定抗性技术相比,该方法具有接种强度大、诱导发病快、测定方法简便等优点,但对一般抗性、整株或成年株抗性、抗介体传毒等类型的抗性鉴定有局限性.     

进境美国小麦中小麦线条花叶病毒检疫鉴定

小麦线条花叶病毒(WSMV)是我国进境植物检疫性有害生物。2016年11月天津出入境检验检疫局通过反转录PCR(RT-PCR)和双抗体夹心酶联免疫吸附(DAS-ELISA)方法,从美国小麦中检出WSMV。利用实时荧光PCR(Realtime RT-PCR)、免疫捕获RT-PCR(IC-RT-PCR)和序列比对分析等方法进行了验证。这是我国在进境小麦中截获WSMV的首次报道。     

美国甜豆中2种壳二孢综合症病菌的检疫鉴定

从进境邮件截获的美国甜豆中分离到两株可疑菌株,通过菌落特征、分生孢子形态比较、ITS和G3PD基因扩增、核酸序列比对、系统发育分析及致病性测定,确定截获的两株菌分别为豌豆脚腐病菌(Phoma pinodella)和豌豆球腔病菌(Ascochyta pinodes),这是我国首次从同一样品中同时检出两种壳二孢属真菌。     

天津滨海新区泡桐丛枝病植原体16S rDNA基因序列分析

利用分子生物学技术对天津滨海新区泡桐丛枝病病原进行分类鉴定。采用植原体16S rDNA通用引物R16mF2/R16mR1对患病植株总DNA进行PCR扩增,得到约1.4 kb特异性片段。克隆测序、Blast比对和iPhyClassifier分析结果表明,天津滨海新区泡桐丛枝植原体16S rDNA基因片段长1 432 bp,与国内泡桐丛枝植原体PY株系相似性最高,达99.86%,归属于16SrI组(aster yellows group,翠菊黄化组)D亚组。系统树构建与分析显示,泡桐丛枝病天津滨海株PaWB-TJBH与16SrI其他亚组亲缘关系较近,同在16SrI组进化枝上,与16Sr I-D组亲缘关系最近;16S rDNA序列RFLP电子酶切图谱表明,PaWB-TJBH属于16SrI-D组一个成员,与同源性比较和系统进化分析结果一致。     

豌豆种传花叶病毒检测鉴定

豌豆种传花叶病毒(pea seed-borne mosaic virus,PSbMV)世界广泛分布,在国外已造成豌豆大量减产,国内有仅小范围低密度分布的报道。加拿大豌豆种子中挑拣皱缩、黑斑等症状的豌豆,先采用双抗体夹心酶联免疫吸附(DAS-ELISA)方法检出PSbMV阳性,再利用反转录PCR(RT-PCR)、序列比对分析和构建系统进化树对阳性样本进行验证鉴定,结果显示与PSbMV序列相似度为99.25%,综上确定从进境豌豆种子中检出豌豆种传花叶病毒。