2个抗虫棉的外源Bt基因分子鉴定及其染色体定位

以中美2个抗虫棉品种GK19与33B为试验材料,利用检测中美Bt基因的特异性引物,分别对抗虫棉亲本GK19和33B进行PCR扩增,并通过SSR分子标记技术对其Bt基因进行分子鉴定与染色体定位,旨在从外源基因转化事件的视角探究中美转基因抗虫棉差异的分子基础。结果表明, GK19为中国转Bt基因抗虫棉, 33B为美国转Bt基因抗虫棉; GK19的Bt基因被定位在棉花Chr.20上,共16对SSR多态性标记与其Bt基因连锁,两侧的分子标记为NAU3907和NAU2579,其遗传距离分别为2.4 cM和1.5 cM; 33B的Bt基因被定位在棉花Chr.26上,共20对SSR多态性标记与Bt基因连锁,目标Bt基因位于标记NAU460和dc40260之间,其遗传距离分别为3.6 cM和2.0 cM。以上结果表明GK19和33B属于不同的遗传转化事件。     

Dynamics of Bt cotton Cry1Ac protein content under an alternating high temperature regime and effects on nitrogen metabolism

This study was conducted to investigate the effects of alternating high temperature on Cry1Ac protein content on Bt cotton cultivars Sikang 1(SK-1,a conventional cultivar)and Sikang 3(SK-3,a hybrid cultivar).In 2011 and 2012,cotton plants were subjected to high temperature treatments ranging from 32 to 40℃ in climate chambers to investigate the effects of high temperature on boll shell insecticidal protein expression.The experiments showed that significant decline of the boll shell insecticidal protein was detected at temperatures higher than 38℃ after 24 h.Based on the results,the cotton plants were treated with the threshold temperature of 38℃ from 6:00 a.m.to 6:00 p.m.followed by a normal temperature of 27℃ during the remaining night hours(DH/NN)in 2012 and 2013.These treatments were conducted at peak boll growth stage for both cultivars in study periods of 0,4,7,and 10 d.Temperature treatment of 32℃ from 6:00 a.m.to 6:00 p.m.and 27℃ in the remaining hours was set as control.The results showed that,compared with the control,after the DH/NN stress treatment applied for 7 d,the boll shell Cry1Ac protein content level was significantly decreased by 19.1 and 17.5% for SK-1 and by 15.3 and 13.7% for SK-3 in 2012 and 2013,respectively.Further analysis of nitrogen metabolic physiology under DH/NN showed that the soluble protein content and the glutamic pyruvic transaminase(GPT)activities decreased slightly after 4 d,and then decreased sharply after 7 d.The free amino acid content and the protease content increased sharply after 7 d.The changes in SK-1 were greater than those in SK-3.These results suggest that under DH/NN stress,boll shell Cry1Ac protein content decline was delayed.Reduced protein synthesis and increased protein degradation in the boll shell decreased protein content,including Bt protein,which may reduce resistance to the cotton bollworm.     

转Cry抗虫基因玉米对家蚕的安全性评价

家蚕可能通过取食漂移到桑叶上的玉米花粉从而受到转基因玉米中表达的Cry蛋白的影响。实验采用室内生物测试的方法评价了转cry1Ab和cry2Ab基因玉米GAB-3花粉对家蚕可能产生的影响,并采用在饲料中掺入蛋白的方式检测了转基因玉米中广泛使用的6种Cry杀虫蛋白对家蚕的毒性。当桑叶上GAB-3花粉密度为50粒·cm^-2时,对家蚕幼虫存活率无显著影响,达500粒·cm^-2时,家蚕14 d存活率为0;以10粒·cm^-2的GAB-3花粉饲喂家蚕幼虫7 d对其体重无显著不利影响,但延长饲喂时间或者当GAB-3花粉密度为50粒·cm^-2时,家蚕的体重显著低于对照组;转基因和非转基因玉米花粉处理14 d或更长时间的家蚕体重均低于无花粉处理组。与非转基因对照处理组相比,低于100粒·cm^-2的转基因玉米GAB-3花粉处理组家蚕的化蛹率、茧重、茧壳重和蛹重无显著差异,转基因玉米和非转基因玉米花粉处理均会延长家蚕幼虫的发育历期。GAB-3花粉对家蚕7 d的LC₅₀为261.18粒·cm^-2,随着处理时间延长,LC₅₀下降。测试的6种Bt杀虫蛋白对家蚕的毒性依次为Cry1C>Cry1Fa>Cry1B>Cry2A>Cry1Ab>Cry1Ac。目前,在中国接近商业化的转基因玉米中多采用的Bt杀虫蛋白为Cry1Ab和Cry2A,二者对家蚕的毒性较低,并且在实际生产中,家蚕接触到的转基因玉米花粉密度较低,因此转Cry抗虫基因玉米对家蚕的风险较低。     

棉铃虫围食膜中Bt抗性相关蛋白的分离与鉴定

棉铃虫是世界性的重要农业害虫。围食膜作为昆虫抵御病原微生物入侵及有害物质的第一道天然保护性屏障,其上可能存在与Bt抗性相关的受体蛋白。本研究以Bt Cry1Ac抗性和敏感品系的棉铃虫围食膜为对象,采用NuPAGE电泳技术、配体杂交、质谱鉴定和生物信息学分析等技术,测定了围食膜蛋白含量,鉴定了蛋白质的组成及与Bt Cry1Ac毒素的结合能力。结果表明敏感品系围食膜中蛋白含量为22.19%,抗性品系围食膜中蛋白含量为26.99%。抗、感品系棉铃虫围食膜上存在与Cry1Ac毒素结合的6个差异蛋白,推测其中棉铃虫羧酸酯酶蛋白和血影蛋白是2个有意义的抗性相关蛋白,2个新蛋白可能参与Bt抗性。研究证明棉铃虫围食膜上存在Bt结合蛋白且与抗性相关,为进一步明确Bt抗性机制、制定合理的Bt抗性治理策略提供了理论依据。     

苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因转化美洲黑杨的研究

本研究首先建立了美洲黑杨叶片外植体的再生系统，并利用Ｈｏｒｓｃｈ等人１９８５年发明的叶盘法，将分别带有嵌合基因ＮＰＴＩＩ和１．８ｋｂ或２．１ｋｂ Ｂｔ．基因的土壤杆菌ＬＢＡ４４０４与美洲黑杨叶片共培养。采用３０ｍｇ／ｌ和５０ｍｇ／ｌ两种浓度的卡那霉素筛选转子，约２８天左右的时间，有不定芽从外植体切口处形成。两种卡那霉素浓度下共形成２７５个伸长芽，存活了１８７株。这１８７株分别进入卡那霉素３０ｍｇ／     

飞机喷洒Bt粉剂防治天然胡杨林春尺蠖技术

应用Y-5B型飞机低量喷洒16 000 IU/mg的Bt可湿性粉剂防治天然胡杨林春尺蠖,用量为1 500 g/hm2和1 200 g/hm2。结果表明两种剂量都具有高效持效的特点,1 200 g/hm2可使虫口减退率达到97%,有效地减轻了春尺蠖对新疆天然胡杨林的危害,防治成本有所下降。     

新疆南部棉区转Bt基因棉花Bt杀虫蛋白表达规律研究

为研究新疆南部植棉区转Bt基因棉花Bt杀虫蛋白时空表达规律,本文利用ELISA技术于2009年和2010年对南疆种植的转Bt基因棉花‘中棉所41’、‘中棉所43’、‘236’、‘K9030’、‘T3’、‘中棉所44’、‘中棉所45’、‘K7’和‘SGK321’各生育期中不同器官中的Bt杀虫蛋白含量进行测定。结果发现：在时间表达上,大多数转Bt基因棉花叶片的Bt杀虫蛋白含量随着棉花发育进程而逐渐下降,在子叶期含量最高,至蕾期或吐絮期达到最低点。并且不同品种间Bt杀虫蛋白含量差异显著。在空间表达上,在花铃期,棉铃和花苞叶的Bt杀虫蛋白含量最低,大多数品种表现为叶片＞棉蕾＞花瓣（花柱）＞棉铃和花苞叶。     

苏云金杆菌(Bt)粉剂对二代松毛虫的防治试验

通过采用苏云金杆菌(B t)粉剂防治二代落叶松毛虫试验,结果表明:以每667 m2用药量1 000 g和1 500 g两个处理防治效果最佳,分别达到了92.3%和94.3%。考虑到生产成本,建议采用每667 m2用药量1 000 g,并用250目以上双飞粉或滑石粉稀释3倍喷粉。     

涝渍对Bt棉棉蕾杀虫蛋白表达含量及氮代谢影响

以Bt棉常规种泗抗1号和杂交种泗抗3号为材料,于盛蕾期设计不同程度涝渍(土壤持水量为最大持水量的90%、100%,渍水2 cm)胁迫4 d以及土壤持水量为最大持水量90%逆境下持续胁迫24~120 h的试验,探讨棉蕾中Bt杀虫蛋白表达量变化及相关氮代谢生理机制。结果表明,土壤不同涝渍程度影响棉蕾Bt蛋白含量。土壤持水量为最大持水量的90%、100%和渍水2 cm处理胁迫后,常规种泗抗1号棉蕾中Bt蛋白含量分别下降36.5%、42.1%和51.4%,杂交种泗抗3号分别下降19.2%、57.2%和64.5%。90%的土壤持水量持续胁迫96 h使棉蕾Bt蛋白含量开始显著下降,泗抗1号和泗抗3号分别下降20.8%和17.6%。随着胁迫时间延长下降幅度增大。不同涝渍程度或水渍持续胁迫条件下,棉蕾中可溶性蛋白含量,硝酸还原酶(NR)、谷氨酸草酰乙酸转氨酶(GOT)、谷氨酸丙酮酸转氨酶(GPT)、谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸合成酶(GOGAT)活性下降,游离性氨基酸含量,肽酶、蛋白酶活性增加。说明涝渍逆境下,棉蕾中蛋白质合成能力下降、分解能力增强,引起可溶性蛋白包括Bt杀虫蛋白含量下降,导致棉蕾抗虫性下降。