表达猪表皮生长因子重组乳酸乳球菌的构建及其对结肠炎模型小鼠肠道损伤的修复作用

本试验旨在构建表达猪表皮生长因子(pEGF)的重组乳酸乳球菌(L. lactis),并评价其对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎模型小鼠肠道损伤的修复作用,为将表达pEGF重组L. lactis应用于断奶仔猪肠道保护提供重要的依据。设计含有3个拷贝数的pEGF同向串联基因序列,并进行L. lactis密码子优化,将合成的3pEGF基因片段与表达载体pNZ8148连接,构建表达pEGF的重组L. lactis。选用32只BALB/c小鼠,随机分为4组,每组8只。采用4%的DSS建立小鼠结肠炎模型,各组小鼠具体处理如下:正常对照组,试验第1～12天饮用自来水;DSS模型对照组,试验第1～7天饮用4%的DSS水溶液,第8～12天饮用自来水;L. lactis组,饮水按照DSS模型对照组处理,同时每天口服1×1012CFU L. lactis,连续12 d;重组L. lactis组,饮水按照DSS模型对照组处理,同时口服1×1012CFU表达pEGF的重组L. lactis,连续服12 d。结果显示:1)通过序列鉴定可知,3pEGF基因成功转入L. lactis;Western blot分析表明所表达的pEGF能与特异性抗体相结合,初步证明该重组蛋白具有活性。2)与正常对照组相比,DSS模型对照组小鼠结肠长度显著降低(P0.05);与DSS模型对照组相比,重组L. lactis组小鼠结肠长度显著增加(P0.05)。3)与正常对照组相比,DSS模型对照组小鼠结肠闭锁蛋白(occludin)浓度显著降低(P0.05),D-乳酸(D-LAC)浓度显著升高(P0.05),二胺氧化酶(DAO)活性极显著升高(P0.01);与DSS模型对照组相比,重组L. lactis组小鼠结肠occludin浓度显著升高(P0.05),D-LAC浓度显著降低(P0.05),DAO活性极显著降低(P0.01)。4)与正常对照组相比,DSS模型对照组小鼠结肠白细胞介素-10(IL-10)浓度极显著降低(P0.01),白细胞介素-4(IL-4)浓度显著降低(P0.05),肿瘤坏死因子-α(TNF-α)浓度极显著增加(P0.01);与DSS模型对照组相比,重组L. lacits组小鼠结肠IL-10浓度极显著增加(P0.01),IL-4浓度显著增加(P0.05),TNF-α浓度有降低的趋势。由此可见,本试验成功构建了表达pEGF的重组L. lacits,重组pEGF具有良好生物活性;小鼠口服表达pEGF的重组L. lacits可抑制结肠的缩短,改善结肠结构和通透性,调节细胞因子浓度到达正常水平,这说明表达pEGF的重组L. lacits维护了肠道屏障功能的完整性,对损伤的肠道具有一定修复作用。     

云南独龙鸡和红原鸡卵巢组织转录组水平的比较分析

为明确独龙鸡的基因功能和种质特性，试验采集3羽健康状况良好的独龙鸡卵巢组织进行转录组测序，并与饲养条件基本相似并且同周龄的红原鸡卵巢组织进行比较。结果表明，与红原鸡相比，独龙鸡中差异表达基因共有7 404个。KEGG和GO富集分析表明，差异表达基因主要富集在GTP酶激活剂活性、膜结构、泛素蛋白连接酶活性和ATP结合等过程，并参与Ras信号通路、硒化合物的代谢通路、SNARE因子在囊泡运输中的相互作用等通路。对显著性通路分析发现，独龙鸡在蛋品质和免疫抗性上具有一定优势，但在产蛋性能上与红原鸡还存在一定差距。说明NCBP1、NCBP2、TXNRD1、PTEN、ENOX1基因主要富集在抗性、产蛋性能和蛋品质相关通路中，可进一步深入研究。     

父亲印象

父亲今年52岁,皮肤黝黑,勤劳朴实,典型的农家汉子。他是个不善于表达感情的人,虽然严厉但默默爱着自己的孩子。幼年时,我对父亲的印象是一个大大的帆布包。那时父亲在农场的窑厂工作,每天都要骑着自行车到六七公里外的窑厂上班,帆布包挂在自行车后座上。那时候厂里没有食堂,家里条件也不好,帆布包里总是带着奶奶烙的煎饼和咸菜,一去就是一天。     

采食后奶牛瘤胃短链脂肪酸及其吸收相关蛋白表达的研究

本试验旨在研究奶牛采食前后瘤胃中短链脂肪酸(SCFA)浓度的变化及其吸收相关蛋白表达量的差异。试验选用3头体重(720±30)kg且装有瘘管的健康荷斯坦牛(动物伦理审查编号为SXAU-EAW-2019-C002013),采食精粗比为40:60的日粮(10kg),试验预试期10d,于第11天饲喂前开始取样,采用气相色谱法检测奶牛采食前(0 h)和采食后(1、2、3、4、5、6、7、8 h)瘤胃液中SCFA浓度;并采用荧光定量PCR方法检测瘤胃上皮组织中与SCFA吸收相关的蛋白表达量。结果表明:在采食后1 h奶牛瘤胃中SCFA浓度最高(P<0.05);在采食后一段时间内(2~5h)与SCFA吸收相关蛋白表达量上调(P<0.05),AE2、MCT1基因表达量均在5 h最高,PAT1、NHE3基因表达量均在4 h最高,MCT4基因表达量在4、5、6h均较高,NHE1基因表达量在2h达到最高;AE2、MCT1、MCT4、NHE1基因表达量与SCFA浓度负相关或正相关(P<0.05),AE2、MCT1、MCT4基因表达量与瘤胃内pH正相关(P<0.05)。以上结果初步揭示,在采食后一定时间内,瘤胃中与SCFA吸收相关蛋白表达受SCFA浓度和pH的调节。     

醋柴胡多糖VBCP-3的结构和抗炎作用研究

分离纯化醋柴胡多糖,分析其结构并探讨其对脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7炎症反应的影响。用水提醇沉法提取醋柴胡粗多糖;Sevage法脱蛋白,再通过DEAE-Sepharose fast flow柱层析纯化得到醋柴胡精多糖,紫外扫描法和高效凝胶渗透色谱法测定精多糖的纯度及分子量,红外光谱法确定糖链上的官能团类型,GC-MS法测定单糖组成,MTT法测定精多糖对巨噬细胞RAW264.7存活率的影响,Griess试剂法测定精多糖对LPS诱导小鼠巨噬细胞的NO分泌量的影响。由此得到醋柴胡精多糖VBCP-3,VBCP-3为吡喃糖,不含蛋白质和核酸,分子质量为436.221 ku,其单糖组成为鼠李糖∶阿拉伯糖∶半乳糖∶葡萄糖=1.3∶24.9∶3.2∶1.00。VBCP-3对巨噬细胞RAW264.7无显著毒性。与模型组比较,VBCP-3能显著抑制NO的释放量(P0.01)。醋柴胡多糖VBCP-3是一种单糖组成丰富的杂多糖,具有一定的抗炎活性。     

白玉菇酸性磷酸酯酶的分离纯化及酶学性质研究

[目的]对白玉菇酸性磷酸酯酶进行分离纯化,并研究其酶学性质.[方法]以白玉菇为材料提取酸性磷酸酯酶(ACPase,EC.3.1.3.2),进一步将原酶液盐析、层析2种常用的蛋白纯化技术,分离得到酸性磷酸酯酶,并对该酶的酶学性质进行研究.[结果]该酶分子量约为70 kD,水解对硝基苯磷酸二钠(pNPP)最适pH为4.5,等电点为5.5,最适温度为40℃,该酶在50℃时有热激活效应;紫外吸收光谱测定结果表明,酶有2个吸收峰,分别在220和280 nm处;耐热时间表明在40℃下耐热保温40 min后,酶活力为最大活力的60.79％,并在保温20 min时酶活力最大,50℃时酶活力随着保温时间的延长而降低,保温20 min后,酶活力下降为最初酶活力的20.77％;Hg2+、Pb2+、Ag+、Cd2+4种金属离子对酶活性均有抑制作用,Ag+抑制作用最强.酶的动力学参数Km为0.031 mmol/L、Vmax为0.204 mmol/(L·min)、酶反应初速度为18.66×10-3μmol/L.[结论]酸性磷酸酯酶的活性受温度、pH、金属离子等外界条件的影响,因此在栽培过程中需要控制环境温度及培养基酸碱度等条件.     

绵羊WNT5A基因克隆及其组织表达分析

WNT5A(Wnt family member 5A)参与了多种细胞的增殖、凋亡和分化等生物学过程,在乳腺形态发生、毛囊发育等方面发挥了重要作用。该试验利用RT-PCR获得绵羊WNT5A基因的CDS区,分析WNT5A蛋白的结构特征并利用RT-qPCR检测WNT5A基因在9个组织中的表达情况。绵羊WNT5A基因的CDS区全长1062 bp,编码353个氨基酸。该蛋白的二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主,β转角、延伸链贯穿于整个蛋白质结构中。String分析结果表明,WNT5A与卷曲蛋白受体、低密度脂蛋白相关蛋白和受体酪氨酸激酶有相互作用。RT-qPCR研究结果表明,WNT5A基因表达具有组织特异性及品种特异性。WNT5A基因在绵羊心脏、肝脏、肺脏、脾脏、肾脏、卵巢、背最长肌、乳腺和皮肤9个组织中均广泛表达,其中在皮肤中的表达量高于其他组织(P<0.05),而在脾脏中表达量较低。它在甘肃高山细毛羊皮肤、乳腺、背最长肌、肾脏、肺脏、脾脏和肝脏中的表达量高于小尾寒羊(P<0.05),而在甘肃高山细毛羊卵巢中的表达量低于小尾寒羊(P<0.05),在心脏中该基因的表达量无差异(P>0.05)。该结果为深入研究绵羊WNT5A基因的功能提供了重要依据,同时也丰富了绵羊基因组内容。     

月季R2R3-MYB转录因子全基因组鉴定与分析

月季是世界著名的观赏植物,具有极高的观赏价值和经济价值.本研究基于月季基因组利用生物信息学对月季R2R3-MYB基因家族进行全面鉴定,并对这些基因的结构、保守域和组织特异表达进行研究,解析月季R2R3-MYB转录因子在月季发育过程中的生物学功能.根据己报道的拟南芥R2R3-MYB基因,利用本地BLAST以及Hmmer工具鉴定月季基因组(Rosa chinensis' Old blush')中的R2R3-MYB基因,共鉴定出120个月季R2R3-MYB家族基因.系统进化树分析表明,月季R2R3-MYB家族基因可被分为34个亚组;其家族成员氨基酸序列N端均含有2个不等重复结构域R2和R3;基因结构分析显示,月季R2R3-MYB家族基因含有1～11个外显子;染色体定位发现120个基因分别定位在月季的7条染色体上,并发生8次串联重复事件;通过对基因组相关性分析共发现16对重复基因的R2R3-MYB基因簇.基因表达模式分析表明,120个基因在月季发育中均有表达,根据表达聚类分析可分为6个亚组,每个亚组之间存在表达差异.     

稻曲病菌交配型基因MAT1-2-1和MAT1-2-8的特性分析

 有性生殖在真菌的生活史和进化过程中具有重要作用,而交配型基因是控制有性生殖的关键因子。前期研究发现稻曲病菌(Villosiclava virens)MAT1-2型菌株中包含MAT1-2-1和MAT1-2-8两个交配型基因,但是它们如何调控稻曲病菌有性生殖依然不清楚。本文研究了它们在不同侵染和生长发育时期的表达模式和编码的蛋白结构特性。研究表明MAT1-2-1在侵染不同阶段一直下调表达;而MAT1-2-8在侵染早期(5 dpi)上调表达,在侵染后期下调表达。与营养菌丝阶段比较,MAT1-2-1和MAT1-2-8在有性发育过程菌核形成、菌核萌发、子座原基形成和子座成熟4个阶段的表达量都是下降的,在菌核形成阶段表达量最低。生物信息学分析显示MAT1-2-1和MAT1-2-8具有磷酸化位点,为非分泌蛋白,无明显的跨膜结构域。蛋白同源比对分析表明MAT1-2-1与香柱菌(Epichloë typhina)的MAT1-2-1同源性最高,而MAT1-2-8与绿僵菌(Metarhizium)的MBR_08192蛋白同源性最高。进一步研究发现MAT1-2-1和MAT1-2-8能够互作,并分别主要定位在细胞核和细胞基质中。通过质谱技术鉴定到MAT1-2-1的一些候选互作蛋白,如假定Ran交换因子Prp20/Pim1(KDB12229.1)、假定rRNA处理蛋白Ebp2(KDB12923.1)及组蛋白H1(KDB12711.1)等。因此,以上结果为研究稻曲病菌交配型基因MAT1-2-1和MAT1-2-8调控有性生殖的生物学功能奠定了基础。     

黄沙鳖β-防御素基因克隆及其表达分析

[目的]明确β-防御素在黄沙鳖先天免疫中的潜在作用,为开展黄沙鳖绿色病害防治及促进其养殖业健康发展打下基础.[方法]运用RACE克隆黄沙鳖β-防御素基因(Hs-BD1)cDNA序列,采用SignalP-5.0、PredictProtein、PSIPRED、Robetta和Clustal X等在线软件进行生物信息学分析,并通过实时荧光定量PCR检测Hs-BD1基因在黄沙鳖不同组织中的表达特征及细菌感染前后的表达变化.[结果]Hs-BD1基因cDNA序列全长493 bp,包括72 bp的5'非编码区(5'-UTR)、201 bp的开放阅读框(ORF)及220 bp的3'非编码区(3'-UTR).Hs-BD1基因编码66个氨基酸残基,包括22个氨基酸残基组成的信号肽区、3个氨基酸残基组成的前肽区和41个氨基酸组成的成熟肽区.其中,成熟肽区具有6个保守的半胱氨酸残基(31Cys、58Cys、38Cys、52Cys、42Cys和59Cys)及位于C1和C2间的甘氨酸残基(Gly),即Hs-BD1基因属于β-防御素家族.Hs-BD1氨基酸序列与中华鳖β-防御素16的相似性最高(93.9%),基于β-防御素序列相似性构建的系统发育进化树也显示黄沙鳖与中华鳖和西部锦龟聚为一支,其亲缘关系相对较近.6个保守的半胱氨酸残基分别以C1-C5、C2-C4和C3-C6的连接方式形成3个二硫键;Hs-BD1成熟蛋白三级结构是由α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲组成.Hs-BD1基因在黄沙鳖肝脏、脾脏、肺脏和肾脏中的相对表达量较高,在心脏、肠道、肌肉、脑组织和表皮中的相对表达量均较低;以温和气单胞菌攻毒后,Hs-BD1基因在黄沙鳖脾脏中的相对表达量呈上升—下降—上升—下降的变化趋势,在攻毒后第3和36 h共出现2个表达峰值,对应的相对表达量分别是攻毒前(0 h)的20.8和10.6倍,差异均极显著(P<0.01).[结论]Hs-BD1基因在黄沙鳖的多个组织中均有表达,尤其在肝脏、脾脏、肺脏和肾脏中的相对表达量较高,且可被温和气单胞菌感染诱导表达,说明Hs-BD1基因在黄沙鳖抵抗病原感染的过程中发挥调控作用.