黑斑蛙蝌蚪出血病病原菌的分离鉴定及药物敏感性

为确定黑斑蛙蝌蚪出血病的病原菌并筛选出防治该病的药物,本研究从患出血病蝌蚪体内分离出菌株KD-CXB-1,健康蝌蚪在人工感染该菌后出现与自然感染蝌蚪相似的出血症状.同时从人工感染死亡蝌蚪体内分离到与菌株KD-CXB-1形态特征及生理生化特性一致的优势菌株,以上结果表明KD-CXB-1为黑斑蛙蝌蚪出血病的病原菌.实验进一...     

草鱼IFNa和IFNd重组蛋白表达、纯化及单克隆抗体制备

为系统研究草鱼I型干扰素的合成、分泌和免疫功能,本研究在大肠杆菌中表达并提纯了草鱼IFNa（CiIFNa）和IFNd（CiIFNd）重组蛋白。将CiIFNa和CiIFNd成熟肽分别克隆到pET-21d或pEHISTEVb表达载体上,并转化到大肠杆菌中;IPTG诱导表达得到CiIFNa和CiIFNd成熟肽的包涵体,经过盐酸胍变性、蛋白复性和浓缩后,利用AKTA分子筛层析获得了纯度较高的重组蛋白。用重组蛋白免疫小鼠,通过PEG法诱导得到杂交瘤细胞;将稳定分泌抗体的阳性细胞株的细胞悬液注射入小鼠腹腔,制备腹水抗体并进行纯化。本研究纯化了草鱼CiIFNa和CiIFNd各2株抗体,并采用SDS-PAGE、ELISA、Western blot和免疫荧光法对其进行了较全面的鉴定。研究结果表明CiIFNa和CiIFNd单克隆抗体特异性好、效价高,能够特异识别在大肠杆菌和真核细胞中表达的重组蛋白,且不存在CiIFNa和CiIFNd分子间的交叉识别。本研究制备的单克隆抗体为深入研究草鱼干扰素的细胞来源和蛋白表达规律奠定基础。     

3型鲤疱疹病毒白介素10单克隆抗体制备与应用

白介素（Interleukin，IL）10是 脊椎动物Th2细胞（T helper 2 cell）和先天淋巴细胞（Innate lymphoid cell）分泌的一种多效应细胞因子。3型鲤疱疹病毒（Cyprinid herpesvirus 3, CyHV3）ORF134编码IL10样蛋白，本研究构建了ORF134原核表达质粒，在大肠杆菌DE3感受态细胞中表达CyHV3-IL10重组蛋白。SDS-PAGE分析结果表明，重组CyHV3-IL10蛋白约为18 ku，主要以包涵体形式表达。将CyHV3-IL10包涵体进行变性和复性，经分子筛凝胶柱层析纯化获得了纯度较高的重组CyHV3-IL10蛋白，利用CyHV3-IL10重组蛋白免疫小鼠制备了单克隆抗体，通过酶联免疫吸附测定法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）筛选，获得了2株亲和力强的抗体，并利用激光共聚焦技术和Western blotting对抗体进行了鉴定。结果表明，FITC标记的单克隆抗体能够特异性识别HEK293细胞中表达的CyHV3-IL10重组蛋白和感染CyHV3的镜鲤脾和鳃组织中表达的CyHV3-IL10蛋白。CyHV3-IL10单克隆抗体的制备为后续研究CyHV3-IL10蛋白功能和建立CyHV3诊断方法奠定了基础，为CyHV3病毒检测试剂盒的研发提供了新思路。     

斑马鱼肿瘤坏死因子(tnfα)及其受体(tnfrsf1a)应答细菌和病毒感染的表达

肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,Tnf)作为重要的炎症因子,在抵抗细菌和病毒感染以及清除被感染的细胞等方面发挥着重要的作用。对斑马鱼进行腹腔注射免疫刺激物、细菌和病毒病原,并采用荧光定量PCR技术分析tnfα及其受体[tnf receptor superfamily(tnfrsf)member 1a]在肾脏和脾脏中的表达。实验结果显示:tnfα和tnfrsf1a在斑马鱼各组织中均有常量表达。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和聚肌苷酸-聚胞苷酸[polyinosinic acid-polycytidylic acid,poly(I:C)]能够调控肾脏和脾脏中tnfα和tnfrsf1a的表达。腹腔注射嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染斑马鱼后,tnfα在脾脏(48 h和72 h)和肾脏(72 h)中表达显著升高;tnfrsf1a在脾脏(48 h)表达水平也有显著上调。在注射迟缓爱德华氏菌(Edwardasiella tarda)的斑马鱼中,肾脏的tnfα表达显著增加,但在脾脏的表达则完全被抑制;tnfrsf1a基因在脾脏和肾脏(6 h和72 h)有明显上调。鲤春病毒血症病毒(spring viraemia of carp virus,SVCV)感染斑马鱼后,tnfα和tnfrsf1a在感染早期表达量有显著升高;而且在感染1～7 d中,肾脏的tnfrsf1a始终维持高水平诱导表达。实验结果表明:tnfα和tnfrsf1a在鱼类抵抗细菌和病毒感染过程中发挥重要作用。     

鱼类的干扰素系统：研究进展与我国学者的贡献

干扰素（interferon,IFN）是一类具有抗病毒、抗细菌和免疫调节等多种功能的细胞因子。根据其分子结构、受体、信号通路以及生物学功能等,脊椎动物IFNs被分为I型、II型、III型和IV型。鱼类属于低等脊椎动物,是脊椎动物中种类最多的一个类群,也是最早拥有完善且复杂IFN系统的脊椎动物,是研究IFN系统组成、功能和演化的重要对象。根据系统发育关系,鱼类I型IFNs被分成8个亚群,分别为IFNa–IFNf以及IFNh和IFNi。不同亚群可选择性利用不同的受体复合物,通过保守的JAK/STAT信号通路诱导干扰素诱导基因（interferon stimulated genes, ISGs）的表达,从而发挥抗病毒等功能。鱼类II型IFNs有2个成员,即IFN-γ和IFN-γrel,它们可分别利用CRFB13/CRFB6和CRFB17受体,通过STAT1传递信号。目前,在硬骨鱼类中还未鉴定到III型IFNs,但软骨鱼类中已鉴定到了III型IFNs及其受体亚基。IV型IFN是我国学者近期在鱼类和原始哺乳动物中鉴定到的一类新IFN基因,具有显著的抗病毒功能,受体由CRFB12和CRFB4组成。...     

草鱼芳香烃受体ahr1a基因克隆、表达及进化分析

芳香烃受体(Aryl hydrocarbon receptor,AhR)作为配体激活的转录因子在T细胞、单核细胞和树突状细胞(Dendritic cells,DCs)的功能调节方面扮演重要角色,炎症相关细胞因子的产生与AhR信号通路也密切相关。为阐明草鱼(Ctenopharyngodon idella)ahr1a基因在炎症发生过程中的作用,本研究克隆获得了草鱼ahr1a基因cDNA序列,全长2 893 bp,其编码区共2 544 bp,编码847个氨基酸。结构域预测发现草鱼AhR1a蛋白含有螺旋-环-螺旋(Helix-loop-helix,HLH)超家族中bHLH-PAS(Period-aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator single minded,Pre-Arnt-Sim)亚家族的典型结构域。氨基酸序列分析表明,草鱼AhR1a与黄河鲤(Cyprinus carpio)的相似性与一致性最高。系统进化树结果发现草鱼ahr1a基因与金鱼(Carassius auratus)、黄河鲤和斑马鱼(Danio rerio)的同源基因聚在一支。草鱼ahr1a基因在多个组织(肠、鳃、肾、肝、头肾、胸腺、脾、皮肤、脑)中均有表达,其中肠和鳃表达量最高。草鱼感染柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)后,ahr1a在脾(24、48 h)和头肾(12、24 h)中的表达水平显著下降。腹腔注射草鱼呼肠孤病毒(Reovirus of grass carp,GCRV)后,脾和头肾中ahr1a表达水平无明显变化。体外实验结果显示,脂多糖(Lipopolysaccride,LPS)和IL-1β重组蛋白下调草鱼原代头肾白细胞中ahr1a的表达。综上所述,本研究克隆分析了草鱼ahr1a基因并初步证实其参与炎症反应的调控。     

水产动物抗菌肽研究进展

抗菌肽是一类广泛存在于自然界生物体内的小分子多肽物质,为机体固有免疫系统的重要组成部分,对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌、病毒和寄生虫等均具有较好的抑制或杀伤作用。抗菌肽具有无污染、无残留、广谱抗菌及不易产生耐药性等特点,有望代替抗生素用于水产动物病原性疾病的防控。近年来,抗菌肽已在水生甲壳动物、水产软体动物、鱼类和两栖类等水产动物中得到报道,但其分类和作用机制有待深入研究。本文对不同水产动物中的抗菌肽进行了分类,对各类抗菌肽的结构特征和功能进行了分析,并从直接杀伤作用、非膜靶向作用和免疫调节作用等三个方面对抗菌肽的免疫作用机制进行了分析,期望能够为今后在水产动物中开展抗菌肽的相关研究和应用提供一定的理论支持。     

斑马鱼白细胞介素34(Interleukin-34)对细菌和病毒感染的转录应答

白细胞介素34（Interleukin-34,IL-34）是一种多功能细胞因子,在先天免疫和炎症过程中发挥重要作用。利用荧光定量PCR技术分析IL-34在细菌和病毒感染后的表达情况。结果显示,IL-34在健康斑马鱼组织和胚胎发育过程中呈常量表达。腹腔注射脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）和聚肌苷酸-聚胞苷酸(Polyinosinic acid-polycytidylic acid,Poly (I:C))后,斑马鱼脾中IL-34表达在48 和72 h均上调,肠中IL-34表达均显著升高（除LPS刺激24 h时IL-34表达下降外）。斑马鱼感染迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda,E.tarda）后,肠中IL-34表达明显增加（3、9和24 h）,而脾中IL-34的表达则受到抑制（6、9和72 h）。腹腔注射感染鲤春病毒血症病毒（spring viremia of carp virus,SVCV）后,脾（1、3、5和7 d）和肠（1和3 d）中IL-34表达也显著上调。体外分析结果显示,SVCV感染和LPS刺激增强ZF4细胞中IL-34的表达;LPS、IL-1β和IFNφ1诱导脾原代细胞表达IL-34。实验结果表明,鱼类IL-34基因在抵御细菌和病毒感染过程中发挥重要作用。     

斑马鱼白细胞介素34对细菌和病毒感染的转录应答

白细胞介素34（Interleukin-34，IL-34）是一种多功能细胞因子，在先天免疫和炎症过程中发挥重要作用。利用荧光定量PCR技术分析IL-34在细菌和病毒感染后的表达情况。结果显示，IL-34在健康斑马鱼组织和胚胎发育过程中呈常量表达。腹腔注射脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和聚肌苷酸-聚胞苷酸(Polyinosinic acid-polycytidylic acid，Poly (I:C))后，斑马鱼脾中IL-34表达在48 和72 h均上调，肠中IL-34表达均显著升高（除LPS刺激24 h时IL-34表达下降外）。斑马鱼感染迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda，E.tarda）后，肠中IL-34表达明显增加（3、9和24 h），而脾中IL-34的表达则受到抑制（6、9和72 h）。腹腔注射感染鲤春病毒血症病毒（spring viremia of carp virus，SVCV）后，脾（1、3、5和7 d）和肠（1和3 d）中IL-34表达也显著上调。体外分析结果显示，SVCV感染和LPS刺激增强ZF4细胞中IL-34的表达；LPS、IL-1β和IFNφ1诱导脾原代细胞表达IL-34。实验结果表明，鱼类IL-34基因在抵御细菌和病毒感染过程中发挥重要作用。