基于TaqMan qPCR检测凡纳滨对虾样品中虾肝肠胞虫并样检测方法的评价

对山东海阳和潍坊的2个养殖凡纳滨对虾群体取样，采用TaqMan qPCR逐尾检测肝胰腺中的虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)载量，再将提取的DNA样品按5并1(5∶1)、25并1(25∶1)、50并1(50∶1)、100并1(100∶1)和150并1(150∶1)进行并样，检测并样的EHP载量。设定不同临界循环数为假定灵敏度，定性判断各单尾检测阳性及并样组阳性，比较不同并样模式与检测阳性率、诊断灵敏度、诊断特异性等之间的关系以及定量的准确性。结果表明，检测灵敏度过低，会降低高并样率检测的准确性；阳性率在30%以上时，高并样率的检测结果与单样品检测相符性很好；高载量感染的阳性率不低于6.7%时，50∶1以内的并样能准确得出检测结果；低载量感染的阳性率不低于16%时，25∶1以内的并样能得出较好结果；高载量感染的1.3%阳性率和低载量感染的8%阳性率可能导致所有并样出现假阴性结果；各种并样模式均有很好的诊断特异性，50∶1并样的诊断灵敏度与OIE标准推荐的5∶1并样的接近；各并样检测的EHP载量与单样品检测平均值之比在0.27~2.83范围，二者存在极显著相关性，各种并样模式的定量检测结果在数量级水平能大致反映样品的平均EHP载量。本研究为水生动物疫病诊断和流行病学调查的样品检测提供了参考依据。     

2016～2017年中国沿海省市虾类偷死野田村病毒(CMNV)分子流行病学调查

偷死野田村病毒(CMNV)引起的病毒性偷死病(VCMD)使中国对虾养殖业遭受了严重的经济损失，为查明CMNV及其变异株的分子流行病学特征，本研究采用逆转录套式PCR (RT-nPCR)、逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)和TaqMan实时荧光定量PCR(TaqMan RT-qPCR) 3种方法，对2016~2017年中国沿海省市CMNV及一种新型野田村病毒——行动障碍野田村病毒(MDNV)的流行、分布和变异情况进行了分析。结果显示，养殖凡纳滨对虾、中国明对虾、日本囊对虾、斑节对虾和罗氏沼虾等种类中均可检测到CMNV阳性；在河北、山东、浙江、福建、广东和海南等省市采集的患病对虾中均存在CMNV。基于RT-nPCR、RT-LAMP和TaqMan RT-qPCR的检测结果显示，2016和2017年样品中CMNV的阳性检出率依次分别为11.8%和7.8%，6.7%和3.9%，17.7%和12.4%；基于上述3种方法检测结果计算得出，2016和2017年样品中CMNV的阳性检出率分别为26.8%和16.3%；基于RT-LAMP的分析显示，2016年样品中MDNV的阳性检出率为9.4%。本研究表明，中国沿海省市养殖虾类中VCMD的流行和危害仍不容忽视，RNA依赖的RNA聚合酶基因不断变异导致前期基于该基因开发的CMNV检测方法可靠性下降，检出假阴性风险升高；同时，发病对虾中出现了新的野田村病毒株系且具有较高的流行率，其传播危害风险值得高度关注。     

凡纳滨对虾感染虾肝肠胞虫的群体及组织间差异性分析

对来自河北黄骅(HH)、山东平度(PD)、江苏吴江(WJ)和山东日照(RZ)的4个凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)群体进行了对虾生长参数测量,用Taq Man q PCR检测了凡纳滨对虾各群体的肝胰腺组织中和RZ群体多种组织中的虾肝肠胞虫数量(Amount of Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)。结果显示,在主要生长相关参数中,RZ群体最优,该群体EHP载量也最低。不同群体的样本数EHP对数直方图的模式存在差异,HH和PD群体的EHP对数呈双峰分布,而WJ和RZ群体的EHP对数呈单峰分布,代表EHP在不同群体中可能存在不同的传播模式。EHP对数呈单峰分布的群体或从多峰分布的群体中分离出的高EHP对数子群体的对虾体长或体重与EHP对数呈显著的负相关。RZ群体中,各个体不同组织中EHP从高到低的顺序依次是肝胰腺中肠血淋巴鳃肌肉。肝胰腺、中肠和鳃3个组织中EHP对数相互间的相关性为99.9%的极显著水平(P0.001);除了中肠与血淋巴和肝胰腺与血淋巴以外,其余组织间EHP对数的相关性也达到极显著(P0.01)或显著(P0.05)水平。用DIG标记的EHP探针对肝胰腺、肌肉、鳃、肠道组织的原位杂交显示,肝胰腺是主要的EHP感染组织,其他组织中杂交信号较弱,但各组织中有少数细胞的EHP易感。     

豆粕粒度及容器堆料对地衣芽孢杆菌实验室固态发酵效果的影响

[目的]对地衣芽孢杆菌的豆粕固态发酵实验室小试工艺中豆粕的粒度和容器内堆料条件进行优化。[方法]在建立豆粕内活菌的有效计数方法的基础上,分析不同混匀方式对发酵豆粕中菌量计数的影响,并研究不同发酵容器、豆粕粒径和堆料厚度对发酵豆粕菌浓度的影响。[结果]发酵后豆粕在PBS振荡1 min能最大程度地释放其中的细菌,以便后续计数;以4层报纸封口的50 m L离心管为发酵容器,采用经80目筛孔的豆粕颗粒和1.5 cm堆料厚度能获得最优的实验室小试发酵效果,菌浓度能达到1.65×1010~1.76×1010CFU/g。[结论]研究为发酵豆粕实验室小试方法提供了技术支持。