草莓6种病毒多重PCR快速检测方法的建立

为快速鉴定草莓病毒病种类以预防病毒病扩散,根据草莓镶脉病毒(strawberry vein banding virus,SVBV)、草莓斑驳病毒(strawberry mottle virus,SMoV)、草莓轻型黄边病毒(strawberry mild yellow edge virus,SMYEV)、草莓白化病毒(strawberry pallidosis-associated virus,SPaV)、草莓病毒1(strawberry virus 1,StrV-1)和芸薹黄化病毒(brassica yellows virus,BrYV)的基因保守区域设计特异性引物,建立了能够同时检测这6种病毒的多重PCR方法。该多重PCR反应体系中,2×SanTaq PCR Master Mix用量为10 μL,上下游引物(10 μmol/L)用量为4 μL,其中SVBV为0.25 μL、SMoV为0.50 μL、SMYEV为0.10 μL、SPaV为0.15 μL、StrV-1为0.50 μL和BrYV为0.50 μL,模板1 μL,ddH₂O为5 μL,总体积20 μL。多重PCR反应程序设定为:94 ℃预变性5 min,94 ℃变性30 s,53 ℃退火30 s,72 ℃延伸120 s,最后72 ℃延伸10 min,循环数为35。该检测体系的灵敏度可以达到10⁷ copies/μL。该多重PCR方法可以同时实现6种草莓病毒的高效快速检测,为草莓病毒病的早期发现和针对性防治提供了技术支持。     

山西草莓斑驳病毒cp基因克隆及遗传多样性分析

旨在研究草莓斑驳病毒（SMoV）在山西省的分布、结构变异及遗传多样性。从山西省7个主要草莓种植区随机采取159份草莓叶片进行RT-PCR病毒检测，结合在线数据库，使用MEGA5构建系统发育树，采用SDTv 1.2软件进行序列相似性分析，运用DnaSP v5.10软件分析cp基因的遗传多样性，采用RDP v.4.31 软件检测SMoV中的重组事件。RT-PCR检测后发现，从山西省各地区收集的159份草莓叶片中有65份样品呈阳性，检出率为38.46%。这些阳性样品经过分离、测序、克隆，获得16个SMoV分离物。结合在线的19个SMoV分离物系统进化树分析显示，35个SMoV分离物被分成两组，组1包含28个分离物，均来自中国；组2包含7个分离物，分别来自加拿大、日本和美国。经选择压分析和中性检验，组1和组2 SMoV分离物之间存在显著的遗传差异，且中性检验均为负值，SMoV种群呈扩张状态。序列相似性分析表明，35株分离物的核苷酸同一性为81.34%~100%，氨基酸的一致性为94.77%~100%，呈现出较高的相似性。可见：SMoV存在较高的遗传变异，负选择压力可能是导致SMoV遗传多样性的原因。     

利用NASBA技术检测草莓斑驳病毒

依赖核酸序列的扩增(Nucleic acid sequence based amplification,NASBA)技术是以cDNA为中介体在等温条件下直接扩增单链RNA特异序列的核酸扩增技术,研究探索利用NASBA技术检测草莓斑驳病毒(Strawberry mottle virus,SMoV)。在对14个SMoV分离物序列分析的基础上,设计和筛选出适于SMoV检测的NASBA引物。NASBA检测SMoV的适宜反应温度为40℃。在9份草莓样品上检测SMoV的结果显示,NASBA检测结果与RT-PCR的检测结果一致,这表明初步建立了利用NASBA技术检测SMoV的技术体系。这是利用NASBA检测SMoV的首次报道。     

草莓叶片不同保存方法对RT-PCR检测 草莓斑驳病毒效果的影响

植物样本保存方法不当易导致样本枯萎和腐烂，严重影响病毒检测结果。为提高PCR法检测草莓斑驳病毒（strawberry mottle virus，SMoV）的效果，明确待检测植物样本的有效保存条件，将经过RT-PCR检测感染SMoV的草莓叶片作为试验材料，设置自然风干保存、硅胶干燥保存和氧化钙（CaO）干燥保存3种不同的干燥保存条件。采用试剂盒法提取各处理草莓叶片总RNA，设计特异性引物进行RT-PCR检测。比较得到最佳干燥保存条件后，再以几种常见的低温、干燥保存为对照，分析草莓叶片不同保存方法对草莓斑驳病毒PCR检测效果的影响。电泳结果显示，含有SMoV的草莓叶片在CaO干燥保存条件下PCR检测效果最好，且操作简单易行。该方法可以为高效、便捷的保存带毒草莓叶片样本提供参考，适用于田间大量样品的采集，提高检测效率。