柱型苹果MdCoLBD1/2基因生物信息学及SNP分析

柱型苹果(Columnar apple)是苹果株型育种的珍贵资源.利用同源基因克隆方法,以柱型苹果"威塞克旭"一年生枝上休眠期芽cDNA为模板,克隆得到了LOB DOMAIN家族(LBD)的2个同源基因,命名为MdCoLBD1/2,分别编码195和240个氨基酸.该基因有LBD家族的典型结构域,如C盒、GAS盒、亮氨酸拉链(Leu zipper)结构以及LOB Domain区域等.MdCoLBD1/2分别定位于第10条染色体Chr10:18985568..19005801和MdCoLBD2 Chr10:18985594..19005850区间.MdCoLBD1/2与白梨、葡萄、草莓、椰子、梅、核桃的氨基酸的相似性均在60%以上.聚类分析表明MdCoLBD1和白梨、梅、草莓亲缘关系较近,MdCoLBD2与葡萄、核桃亲缘关系较近,MdCoLBD1/2与亚洲棉、陆地棉的聚类关系均较远.通过测序分析了MdCoLBD1/2基因在30个不同类型材料中的碱基序列差异,得到MdCoLBD1有8个碱基差异位点,MdCoLBD2有5个碱基差异位点.     

人雄激素受体的雄激素结合区cDNA在E.coli中的高效表达

将编码人雄激素受体（ｈＡＲ）的雄素结合区（ＬＢＤ）的ｃＤＮＡ片段（１００５ｂｐ）克隆到由Ｐ１启动子控制的硫氧还蛋白表达载体ｐＴｒｘＦｕｓ上,构建了表达质粒ｐＴｒｘＡＲ,并转化到大肠杆菌Ｇ１７２４中,经色氨酸诱导表达后,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,可观察到一高效表达的融合蛋白产物,此融合蛋白 分子了量与理论值相吻合,氨基酸组分分析证明了ＬＢＤ目的基因的表达。     

人孕酮受体激素结合区基因表达产物的检测与制备

PuPR为含有编码人孕激素受体（hPR）激素结合区（LBD）基因（631-933氨基酸）的pUC19重建质拉,在其宿主Escherichiacoli（BL21）中,经1mmol/L的IPTG诱导,该转化的细菌产生一C端为6×His结尾的蛋白质,分子量45KD。该表达产物可利用Ni-NTAHRP在ng水平用Western印迹检测,并可通过亲和层析的方法,利用His－bindingresin（Ni树脂）从菌体的裂解液中方便地回收到该蛋白质。     

长穗偃麦草LBD基因家族的鉴定与进化分析

为深入研究长穗偃麦草LBD基因家族中基因的结构与功能以及小麦与其近缘属的进化关系,以长穗偃麦草LBD（Lateral organ boundaries domain）基因家族为研究对象,生物信息学分析发现该基因家族含有32个成员,根据其结构域特征,可分为Class Ⅰ和Class Ⅱ两个亚家族,Class Ⅰ又可分为Ⅰ_A、Ⅰ_B、Ⅰ_C、Ⅰ_D和Ⅰ_E,Class Ⅱ可分为Ⅱ_A和Ⅱ_B;该基因家族的结构域、基因结构相对保守,不同成员之间具有相似的蛋白二级和三级结构。对32个基因的上游序列预测,发现基因上游序列中含有光响应、多种激素、逆境响应等顺式作用元件,说明LBD基因的表达受到光、激素、逆境等多种因素的诱导。与普通小麦、圆锥小麦、乌拉尔图小麦、粗山羊草、大麦进行共线性分析发现,Tel-2E-LBD2、Tel-3E-LBD4、Tel-4E-LBD1和Tel-4E-LBD6为长穗偃麦草特有的LBD基因,而其他28个LBD基因在进化中具有高度的保守性;在普通小麦、圆锥小麦、乌拉尔图小麦和大麦基因组中均发现第1、3部分同源群染色体上存在染色体间的片段重复;普通小麦、圆锥小麦和乌拉尔图小麦的A基因组中第4、5部分同源群染色体均有易位现象,同时,乌拉尔图小麦4A染色体上存在染色体内片段重复而在普通小麦和圆锥小麦的A基因组上发现第4部分同源群染色体内易位与倒位。     

LBD基因家族在高等植物中的研究进展

LBD基因是最近在高等植物中发现的为植物所特有的一类新的基因,含有保守的LOB(lateralor-ganboundaries)结构域。研究发现拟南芥和水稻中的LBD基因均为一大的基因家族,LBD基因参与了侧生器官原基的启动、侧生器官的形态建成以及侧生器官与茎尖分生组织(SAM,shootapicalmeristem)之间边界的建立,并与茎尖分生组织中特异表达的部分基因或基因家族间存在相互作用的关系,对高等植物地上部、地下部的特定器官的形成与发育具有重要影响。本文对LBD基因的结构域特征、在单/双子叶模式植物中的分类、表达特点、已克隆LBD基因的功能及与其它基因或基因家族间的相互作用关系进行了综述,并对LBD基因在高等植物中的功能冗余特性、LOB结构域可能所具有的基本功能和LBD基因与其它基因相互作用的分子机制进行了探讨。     

辣椒全基因组中LBD转录因子的鉴定与表达分析

利用生物信息学的方法,从辣椒基因组中鉴定出45个LBD基因,这些基因分布于辣椒9条染色体上。该家族成员内含子数整体上不超过3个,结构相对简单。进化关系显示辣椒LBD基因可分为ClassⅠ和ClassⅡ两大类,细分为Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc、Ⅰd、Ⅰe、Ⅱa和Ⅱb等7个亚类。不同组织和发育时期的表达模式研究发现,该基因家族具有一定的时空表达特异性。qRT-PCR结果表明,热激胁迫可以明显激活或抑制部分LBD基因的表达,其中ClassⅡ类基因较ClassⅠ类对高温具有更高的敏感性。     

LBD家族转录因子TtRa2和AtLBD37的表达与纯化

【目的】由于LBD基因编码一类植物特有的空间结构尚未解析的转录因子,拟建立2种LBD家族成员(TtRa2和AtLBD37)及其DNA结合结构域的高效表达与纯化体系,为该家族转录因子的结晶研究奠定基础。【方法】以pET-21a表达载体为基架,设计并构建了pHMT载体,该载体在目标基因上游依次融合了His-tag、MBP和TEV蛋白酶酶切位点。将TtRa2和AtLBD37基因的完整编码区及其DNA结合结构域编码区分别插入pHMT载体,获得重组质粒pHMT-AtLBD37、pHMT-AtLBD37-BD、pHMT-TtRa2、pHMT-TtRa2-BD。将上述质粒导入E.coli表达菌株2566诱导表达,先使用amylose亲和柱纯化获得融合蛋白,再用融合His-tag的TEV蛋白酶切除融合蛋白TtRa2-BD中的His6-MBP双标签,使用Ni-NTA亲和层析柱去除TEV蛋白酶和His6-MBP标签,最后获得目标蛋白。【结果】TtRa2和AtLBD37及其DNA结合结构域均获得了高效可溶性融合表达,其表达量占细胞总蛋白的50%~70%;TtRa2-BD经2步亲和纯化后,每升菌液可获得15mg纯度大于98%的目标蛋白。【结论】成功建立了2种LBD转录因子及其DNA结合结构域的高效表达和纯化体系。     

人雄激素受体LBD基因高效表达条件的优化及产物纯化

人雄激素受体激素结合部的ｃＤＮＡ片段克隆到表达载体ｐＴｒｘＦｕｓ内,在大肠杆菌ＧＩ７２４中可被诱导表达。通过改变诱导培养时间,诱导剂浓度,诱导温度及培养基的ＰＨ,在３４－３７℃,ＰＨ６．４－７．７的培养基中,用１００μｇ／ｍｌＴｒｐ诱导培养４ｈ,可获得高效表达的ＬＢＤ融合蛋白产物。     

人雄激素受体LBD基因融合表达产物的分离制备

利用硫氧还蛋白事例表达系统,将编码人雄激素受体（ｈＡＲ）激素结合区（ＬＢＤ）的基因（编码ｈＡＢ５８４－９１８氨基酸）插入质粒ｐＴｒｘ Ｆｕｓ中ｔｒｘＡ基因的３′端,重组后的质粒ｐＴｒｘＡＲ导入Ｅ．ｃｏｌｉ ＧＩ７２４中,经Ｔｒｐ诱导,该转化的菌株表达一融合蛋白。通过制备包含体,再利用制备型ＳＤＳ－ＰＡＧＥ或Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２００柱层析都可较好地纯化分离该融合表达产物（达到ＳＯＳ电泳单点纯）,