转基因甘蔗BtG-2的T-DNA侧翼序列分析及其转化事件特异性检测

转基因甘蔗BtG-2是利用农杆菌介导法把Cry1Ac-2A-gna融合抗虫基因导入‘新台糖22号’的转基因甘蔗株系,具有良好的抗虫特性和农艺性状。为了明确转基因甘蔗BtG-2的分子特征及其检测方法,推进其生物安全性评价工作,以BtG-2的T2代为研究材料,利用Southern杂交检测外源基因在转基因甘蔗基因组内的拷贝数;利用染色体步移技术分离外源基因在甘蔗基因组中插入位点的侧翼序列,并建立了该转化体高效灵敏的特异性PCR检测方法。结果表明：Southern杂交检测证明外源T-DNA以单拷贝方式插入BtG-2株系;经过3次的热不对称巢式PCR扩增,获得外源基因T-DNA左边侧翼序列984 bp和右边侧翼序列705 bp;以这2个序列和相应的T-DNA的左右端序列分别设计3对检测引物对,建立了BtG-2株系的转化事件特异性PCR检测方法,扩增效率最高的引物对LS011/LA451和RS160/RA588分别扩增到440 bp和428 bp的特异片段。其中T-DNA左侧设计的LS011/LA451检测引物对扩增的灵敏度高、特异性强,能够在甘蔗BtG-2基因组DNA相对含量为0.1%的模板中检测出转基因目的成分,相当于9个单倍体基因组拷贝数。本研究完成了转基因株系BtG-2的分子特征及其转化事件特异性检测,为该转基因甘蔗及其衍生产品的检测和身份识别提供技术依据。     

优化反向PCR法分离转基因油菜外源T-DNA侧翼序列的研究(英文)

[目的]优化反向PCR(IPCR)条件分离油菜转基因外源T-DNA的侧翼序列。[方法]以单拷贝的转基因油菜FS4为研究材料,用SDS法和改良CTAB法(包括低温操作、增加酚氯仿的抽提次数以及延长低温沉淀时间等)提取转基因油菜总DNA,并进行酶切、纯化、自连接,再使用普通聚合酶与热启动高保真的ExTaqHS聚合酶进行两轮巢式PCR扩增,进行序列对比。油菜数据库比对搜索采用BBSRCBrassicaDB上WU-BLAST2.0工具,拟南芥数据库比对分析采用TAIR数据库中WU-BLAST2.0工具。为验证FS4转基因中T-DNA插入位点的真实性,根据序列比对分析结果在T-DNA插入位点的左右两端分别设计引物FS4-L与FS4-R。分别采用3对引物pS2/FS4-L、pA2/FS4-R、FS4-L/FS4-R同时对T1代转基因FS4杂合体和非转基因对照植株的基因组进行PCR验证。[结果]两轮巢式PCR扩增得到1个大小为4.0kb的片段,其序列与油菜数据库中BH652424和BZ044084两序列同源性分别高达97.8%和63.4%。根据序列比对结果设计特异引物对进行PCR验证的结果,也证明了FS4转基因油菜中T-DNA的确插入在该位点。[结论]优化后的IPCR条件能成功分离油菜转基因外源T-DNA的侧翼序列。     

一种快速·有效分离T-DNA插入位点的侧翼序列的方法——DW-ACP-PCR技术

DW-ACP-PCR(DNAWalking-Annealing control primer-PCR)是一种分离已知DNA序列的侧翼未知序列的新技术。该技术通过3个嵌套的特异引物分别和ACPC复性控制引物组合,进行3步连续的PCR反应,所有反应可以在1 d内完成。ACP的特殊结构能有效地控制非特异扩增。用DW-ACP-PCR技术扩增7个稻瘟菌T-DNA插入突变体的T-DNA插入位点的侧翼序列,均获得了特异目标片段。     

甘蔗SPSⅢ基因组DNA及5'侧翼序列的克隆与分析

甘蔗是我国南方地区重要的糖料作物。为达到增糖的育种目标,对甘蔗蔗糖积累主要限速步骤的研究是必不可少的。蔗糖磷酸合成酶(SPS)作为蔗糖合成途径的关键限速酶,对甘蔗中蔗糖合成和碳水化合物分配有着重要的影响。本研究采用长距离PCR法(LD-PCR)克隆到两条不同长度的甘蔗(Saccharum spp.cv.FN95-1702)SPSⅢ基因组DNA片段。序列分析表明,所得的片段基因结构相同,均含有13个外显子和12个内含子,其开放读码框(ORF)编码964个氨基酸,序列提交GenBank,获得查询登陆号EU278617、EU278618。以此为基础,继续从甘蔗基因组中扩增出先前未知的SPSⅢ基因5'侧翼序列,申请GenBank登陆号KC422670。转录因子结合位点生物信息学分析表明,该序列含有顺式DNA作用元件和启动子TATA启动盒。为进一步验证5'侧翼序列的启动子活性,分别截取5段不同长度的SPSⅢ基因5'侧翼序列与报告基因GUS融合,构建嵌合基因表达载体质粒,基因枪微弹轰击甘蔗愈伤组织观测瞬时表达,证实了所克隆到的5'侧翼序列具有启动子活性,是甘蔗SPSⅢ基因的启动子,且具有一定的表达特性。本研究通过克隆分析SPSⅢ基因以其启动子,为研究基因结构和生物学功能提供了基础资料。     

添加萘乙酸(NAA)对雨生红球藻中虾青素积累的影响

近年来,对雨生红球藻合成虾青素几个关键酶基因的转录调控机制也进行了研究,结果表明,β-胡萝卜素酮化酶(bkt)和β-胡萝卜素羟化酶(crtR-B)基因的5′上游侧翼序列中可能存在生长     

基于重测序鉴定耐盐转基因大豆事件外源T-DNA整合位点及特异性检测

[目的]转基因大豆事件L8014是本研究前期利用农杆菌介导的大豆子叶节高效遗传转化技术体系,将来源于山菠菜的基因BADH导入大豆(Glycine max)‘Williams 82’而获得具有良好耐盐(1.5%NaCl)性状的转基因大豆(该材料已经完成环境释放试验)。T-DNA插入位点侧翼序列的获得与分析对于转基因事件的安全评价及应用非常重要,本文旨在明确该转基因大豆材料的分子特征及其检测方法,以进一步推进安全评价。[方法]利用Southern杂交检测转基因大豆外源基因的拷贝数;基于基因组重测序技术,采用BWA(Burrows-Wheeler-Alignment)方法将重测序数据与T-DNA序列以及大豆基因组序列进行比对分析。[结果]T-DNA在大豆基因组10号染色体上的基因组区间3925017—3926022位点,插入方式为反向插入;结合PCR扩增技术获得外源T-DNA整合位点的左、右边界侧翼序列,基于该序列建立了转BADH基因大豆事件L8014的特异性PCR检测方法。[结论]本研究获得了转基因事件的整合位点及侧翼序列,方法快速、结果可靠,为转基因大豆及其衍生产品的检测提供了技术支撑。     

水稻抗白叶枯病T-DNA插入突变体侧翼序列的分离和分析

采用PCR-walking方法对水稻抗白叶枯病突变体G48的侧翼序列进行分析。通过特异性嵌套引物扩增和序列比对分析获得了该突变体T-DNA左、右边界侧翼序列,确定T-DNA插入水稻日本晴第三染色体clone OSJNBa0076E06(AC132215.1)位点上,左、右边界插入位点分别位于该克隆的第93 750、93 824碱基处。PCR-walking方法为T-DNA的侧翼序列分析提供了一种简单、高效的方法。     

猪CstB基因3’侧翼序列的克隆研究

为了获得猪Cst B基因3’侧翼序列,试验以大白猪cDNA为模板,采用RACE克隆方法,根据GenBank上提供的猪外显子3序列设计引物。结果表明:猪Cst B基因3’侧翼序列长度为225 bp,并提交GenBank收录(GenBank登录号为EF483823)。     

TAIL-PCR技术分离柞蚕丝素基因3’端非编码区未知DNA序列

以柞蚕基因组DNA为材料,采用热不对称交错PCR(TAIL-PCR)技术分离出1 998 bp的DNA序列.将该序列与Genebank上的柞蚕丝素基因DNA序列(AF083334)进行比较分析结果表明,新钓取的DNA片断中1 758 bp的DNA序列为柞蚕丝素基因3′端非编码区未知DNA序列.TAIL-PCR技术为柞蚕丝素基因3′端非编码区未知DNA序列的钓取提供了一种简便、高效的方法.