杂交三倍体泥鳅性腺发育观察及其基因表达分析

以杂交三倍体泥鳅(4n♀×2n♂)为研究对象,对其早期性腺分化的组织学进行观察,并采用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术,对杂交三倍体泥鳅早期不同发育时期(孵化后4、14、21、23、50、60和65d)和不同组织(性腺、肝脏、肌肉、肠、鳃、鳍、皮肤和脑)中性腺发育相关基因(hormad1、dmrt1-a)的表达量进行定量检测。研究结果发现:在早期不同发育时期,hormad1和dmrt1-a基因均为在4日龄中表达量最高,14日龄次之,在50日龄中表达量最低。在不同组织中,hormad1基因在雌鱼的鳍中表达量最高,肝脏中表达量最低;在雄鱼的性脑腺中表达量最高,肝脏中表达量最低。dmrt1-a基因在雌雄鱼的性腺中表达量最高,脑中表达量最低。杂交三倍体泥鳅早期性腺的分化和发生与二倍体泥鳅无差别,可观察到原始生殖细胞、原始生殖细胞的迁移和原始性腺的生成及性腺的分化等过程。研究结果表明,hormad1、dmrt1-a这2个基因与杂交三倍体泥鳅早期性腺发育密切相关。     

多倍体泥鳅的人工诱导及其受精细胞学观察

对大鳞副泥鳅(PP)、二倍体泥鳅(DD)和四倍体泥鳅(TT)自交或杂交受精卵进行冷休克(冷休克条件为:受精后5min开始,利用2～3℃冰水冷休克处理30～35min),获得6种多倍体泥鳅后代(DD×PP-0,3n=74;DD×DD-0,3n=75;DD×TT-0,4n=100;TT×PP-0,5n=124;TT×DD-0,5n=125和TT×TT-0,6n=150。母本在前,父本在后)。利用流式细胞仪对不同诱导组合不同时期倍性进行检测发现:1月龄,DD×PP-0三倍体诱导成功率为87.50%,DD×DD-0三倍体诱导成功率为53.85%,DD×TT-0四倍体诱导成功率为90.91%,TT×PP-0五倍体诱导成功率为84.96%,TT×DD-0五倍体诱导成功率为76.92%,TT×TT-0六倍体诱导成功率为12.50%。12月龄,各组合多倍体诱导成功率分别为91.43%(DD×PP-0,3n=74),60%(DD×DD-0,3n=75),85.19%(DD×TT-0,4n=100),87.50%(TT×PP-0,5n=124),83.33%(TT×DD-0,5n=125)和6.06%(TT×TT-0,6n=150)。12月龄各诱导组合多倍体倍性组成与1月龄相似,诱导成功率随诱导多倍体后代的倍性增加而降低。对不同诱导组合后代进行生长统计分析发现:不同诱导组合后代在生长早期差异不显著,生长后期表现出不同程度的差异。其中,以四倍体泥鳅为母本、大鳞副泥鳅为父本的诱导五倍体后代(TT×PP-0)12月龄时期全长和体质量值最大。同时,荧光受精细胞学观察证实冷休克处理通过抑制受精卵第二极体的释放获得三倍体型后代。     

团头鲂肌腱发育相关基因tnmd/xirp2a的克隆和表达

为分析肌腱发育相关基因tnmd/xirp2a与团头鲂肌间骨发育之间的相关性,通过克隆获得团头鲂tnmd/xirp2a的cDNA序列,其中tnmd的cDNA全长为1 420bp,开放阅读框为906bp,共编码301个氨基酸;xirp2a的cDNA全长为11 715bp,包括开放阅读框9 522bp,编码3 174个氨基酸。系统进化研究表明,tnmd/xirp2a基因在不同脊椎动物中保守性很低,且相比哺乳类和家禽类,鱼类tnmd基因存在一段氨基酸的缺失。采用荧光定量方法比较分析tnmd/xirp2a在团头鲂成鱼不同组织及肌间骨发生发育4个关键时期的表达情况,结果显示,tnmd/xirp2a在肌肉和肌间骨中的表达量均显著高于其他组织,且肌肉中tnmd基因表达高于肌间骨(P0.05),而xirp2a在肌间骨中的表达高于肌肉组织(P0.05)。在肌间骨发育4个关键时期(Ⅰ:尾部尚未出现肌间骨;Ⅱ:尾部出现少量肌间骨;Ⅲ:尾部肌间骨大量出现且长度增加;Ⅳ:肌间骨从尾部到背部全部出现且形态成熟)中,tnmd在第Ⅲ时期的表达水平显著高于另外3个时期;在第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ时期之间,xirp2a的表达水平没有显著性差异。此结果表明,tnmd基因在肌间骨的发育过程中存在潜在作用,而xirp2a基因与肌间骨的发育之间的相关性还需进一步研究。     

团头鲂SREBP1基因的克隆及其表达分析

为阐明团头鲂SREBP-1的功能,采用RT-PCR技术克隆获得SREBP-1基因的cDNA序列,利用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测SREBP-1基因在不同发育时期及不同组织中的表达情况。生物信息学分析发现,SREBP-1基因cDNA的编码序列(coding sequence,CDS)为3 426bp(GenBank登录号:MH633449),开放阅读框(ORF)编码1 141个氨基酸,与大西洋鲑、斑马鱼、草鱼、鲤、金线鲃SREBP-1的氨基酸序列相似性较高(74%～99%)。保守结构域分析显示,团头鲂SREBP-1蛋白具有SREBPs家族典型的"碱性螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链"(bHLH-Zip)结构域。表达分析结果显示,SREBP-1基因在团头鲂胚胎发育过程中的表达呈现先下降后增高的趋势,在眼囊期最低,至出膜期达到最高。在团头鲂幼鱼中,SREBP-1在脑组织中的表达量最高,其次是眼、肝脏、心脏、肌肉、脂肪组织、肾脏,鳃中表达量最低。在成鱼中,SREBP-1在脑组织表达量最高,其次是性腺组织、肌肉、肝脏、眼,肾脏、脾脏和心脏中的表达量较低。以上结果表明,SREBP-1基因在团头鲂幼鱼和成鱼的不同组织中的表达模式存在差异。