不同温度下TMV侵染枯斑三生烟的LncRNA差异表达

【目的】 筛选不同温度下烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）侵染后枯斑三生烟（Nicotiana tabacum var. Samsun NN）差异表达的长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）,研究lncRNA在枯斑三生烟抗性反应中的作用。【方法】 N基因的温度敏感性使枯斑三生烟在25℃时具备对TMV的抗性、在31℃抗性丧失,在这两个温度条件下对枯斑三生烟接种TMV和磷酸盐缓冲盐水（phosphate buffered saline,PBS）,48 h后提取系统叶总RNA,构建链特异性文库后进行深度测序。对测序结果进行过滤后利用HTSeq将有效数据与近缘品种TN90（N. tabacum var. TN90）基因组比对,筛选得到lncRNA后利用FPKM法估计lncRNA的表达水平。通过edgeR筛选差异表达lncRNA（differentially expressed lncRNA,DElncRNA）,并利用qRT-PCR技术对这一结果进行验证。通过共定位及共表达分析预测DElncRNA的靶基因,通过参考基因组注释、GO和KEGG富集分析研究靶基因的功能。【结果】 4个处理共12个样本经lncRNA-seq各测得约8 000万条clean reads,共获得4 737条已知lncRNA、40 169条新lncRNA。其中64个lncRNA在不同温度条件下TMV侵染后存在差异表达,qRT-PCR测定结果显示这些lncRNA的测序正确率在80%左右,表明本研究所得测序数据具备较高的可信度。对DElncRNA进行靶基因预测,发现一些基因同时被25℃下调和31℃上调的DElncRNA靶向。靶基因注释功能丰富,主要参与植物抗病、激素和代谢等生理过程。部分可能与激素通路相关的lncRNA,在25℃下TMV侵染时呈现下调趋势,而在31℃下TMV侵染则呈现上调趋势。GO富集分析显示靶基因主要参与构成膜、囊泡等组分,具备钙、钾离子通道抑制剂活性等分子功能,使相应离子得以转运引发随后的反应,同时也参与发病、抗原加工和呈现、细胞分裂素代谢等生理过程。KEGG分析发现靶基因显著富集在植物激素信号转导通路,25℃下调和31℃上调的DElncRNA靶基因同时富集在激素信号传导、ABC运输蛋白、苯丙烷类生物合成等通路。【结论】 不同温度（25℃和31℃）条件下TMV侵染枯斑三生烟后,长链非编码RNA差异表达,DElncRNA通过作用于激素信号传导、物质转运等过程参与寄主系统获得性抗性反应。研究结果可为揭示植物系统获得性抗性中lncRNA的调控功能以及新型抗病毒技术开发提供依据。     

施用小麦秸秆或其生物炭对烟田土壤理化特性及有机碳组分的影响

  【目的】  以2年田间定位试验为依托，研究小麦秸秆及其生物炭连续施用对植烟土壤理化性状和有机碳组分的影响，为烟区土壤质量提升提供依据。  【方法】  田间试验在山东省诸城市潮褐土烟田上进行。试验设4个处理，分别为:常规施肥且秸秆不还田(CK)，常规施肥+小麦秸秆还田(FS)，常规施肥+小麦秸秆生物炭2.25 t/hm2 (FB1)和4.50 t/hm2 (FB2)。在烟叶收获后，采集0—20 cm耕层土样，测定了土壤基础理化指标和总有机碳(TOC)、微生物生物量碳(MBC)、热水溶性有机碳(HWC)、活性有机碳(LOC)及轻组有机碳(LFOC)含量，并计算土壤碳库管理指数(CPMI)。  【结果】  连续施用小麦秸秆或其生物炭2年后，FB1和FB2处理TOC含量显著高于CK，增幅分别为74.9%和116.0%，而FS与CK处理间差异不显著。LFOC含量的变化趋势与TOC类似，FB1和FB2处理LFOC含量分别较CK处理显著增加154%和326%。FS处理HWC含量显著高于CK和FB1处理，而与FB2处理差异不显著。与CK相比，FS处理HWC含量增加了107%。FS和FB2处理MBC含量较CK分别增加了252%和144%，而FB1处理与CK相比差异不显著。FS处理LOC含量较CK显著增加了68.9%，而FB1、FB2处理LOC含量与CK相比差异不显著。FS处理还能显著降低土壤容重、增加土壤含水量及有效磷含量，其对部分土壤理化特性的改良效果优于生物炭处理(FB1和FB2)。此外，CPMI也以FS处理最高，较CK显著增加了73.5%，而FB1、FB2处理与CK处理差异不显著。  【结论】  连续秸秆还田有利于提升烟田土壤活性有机碳(MBC、HWC和LOC)含量，降低土壤容重，提高有效磷含量，提高土壤CPMI。而同量秸秆转化为生物炭后连续还田能够提高土壤总有机碳和轻组有机碳含量，更有利于土壤有机碳的长期固存。     

烟草Hsc70-2的克隆及对马铃薯Y病毒侵染烟草的促进作用

【目的】马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）是危害烟草、马铃薯、番茄、辣椒等主要农作物的重要病毒,给农业生产带来巨大损失。论文旨在克隆Hsc70-2蛋白在本氏烟（Nicotiana benthamiana）中的基因序列并分析其生物学信息,研究NbHsc70-2蛋白对PVY侵染烟草的影响,为进一步解析PVY的侵染机制提供理论依据。【方法】以本氏烟为材料,克隆NbHsc70-2蛋白的基因编码序列（coding sequence,CDS）,利用MEGA 6.0 进行多序列比对并构建系统进化树;利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析NbHsc70-2在本氏烟各组织中的表达水平;采用在线软件BaCeILo和SignalP 4.0对NbHsc70-2进行生物信息学分析;构建NbHsc70-2-RFP融合蛋白确定该蛋白的亚细胞定位;研究PVY处理对本氏烟叶片中NbHsc70-2的影响;利用激光共聚焦观察PVY-GFP处理对NbHsc70-2-RFP定位的影响;构建NbHsc70-2 VIGS沉默体系及瞬时表达载体,采用qRT-PCR比较NbHsc70-2在沉默/过表达后对PVY表达的影响。【结果】NbHsc70-2编码649个氨基酸,系统进化树分析表明,NbHsc70-2与普通烟NaHsc70-2序列相似性最高,亲缘关系最近,属于热激蛋白家族,C端具有热激蛋白家族的高度保守基序结构;qRT-PCR分析表明,NbHsc70-2在叶中表达量最高,在根和茎中的表达量较低;BaCeILo预测及激光共聚焦显微镜观察均显示NbHsc70-2定位在细胞质中,并且PVY-GFP侵染本氏烟后NbHsc70-2-RFP部分转移至细胞核,与PVY-GFP共定位在细胞质及细胞核中;将NbHsc70-2基因沉默载体pTRV::NbHsc70-2导入本氏烟中7 d后相比于对照组,沉默组出现心叶皱缩及矮化现象;接种PVY-GFP 7 d后通过手持紫外灯观察到沉默组中无明显绿色荧光出现,而对照组中PVY-GFP系统侵染使得非接种叶片呈现荧光现象,沉默组荧光点数约为对照组28%;接种PVY后,利用qRT-PCR检测沉默NbHsc70-2后1、3、5 d的PVY CP基因积累量,结果表明沉默NbHsc70-2后PVY CP基因积累量下降,其中3 d和5 d与对照相比差异显著,基因表达水平分别为对照的14%和0.004%;将NbHsc70-2过表达载体pEarleyGate100::GWC::NbHsc70-2与PVY同时导入本氏烟后,结果表明相比于对照组,过表达组48 h和72 h 其PVY CP基因积累量显著上升,基因表达水平分别为对照组的2.31、2.56倍。【结论】PVY侵染会引起NbHsc70-2表达量上升;NbHsc70-2是PVY侵染本氏烟重要的组成成分,沉默该基因显著抑制PVY的表达,过表达NbHsc70-2则显著提高PVY的表达,即NbHsc70-2的表达水平与PVY复制呈正相关,NbHsc70-2蛋白促进PVY对烟草的侵染。     

草地贪夜蛾对玉米和烟草的偏好性研究

自2019年初首先在云南省发现草地贪夜蛾入侵中国以来,该虫已对国家粮食安全构成严重威胁。草地贪夜蛾寄主范围广,主要喜食禾本科植物,同时也能为害多种双子叶植物。本研究以玉米和烟草为测试对象,比较研究了草地贪夜蛾在两种寄主上的产卵量及两种寄主植物对草地贪夜蛾生长发育的影响。结果表明,每个养虫笼中放入2对雌雄成虫,玉米植株上的卵块数量(17±2.65)块/笼显著多于烟草叶片上的卵块数量(3±1.73)块/笼,玉米上的幼虫数量(834.67±275.16)头/笼显著多于烟草上的幼虫数量(92±55.83)头/笼,表明草地贪夜蛾更喜欢选择玉米进行产卵和取食。烟草上草地贪夜蛾幼虫死亡率达92.53%±1.46%,但其能在烟草上产卵和存活。取食玉米籽粒的草地贪夜蛾幼虫发育历期、死亡率、体重、蛹重分别为(17.22±1.90)d、24.35%±8.13%、(0.261±0.112)g/头、(0.187±0.030)g/头,取食烟草叶片的草地贪夜蛾对应的参数分别为(26.80±1.89)d、85.49%±4.16%、(0.034±0.028)g/头、(0.131±0.028)g/头,表明取食烟草叶片的草地贪夜蛾幼虫发育历期显著延长,幼虫死亡率显著升高,幼虫体重和蛹重显著下降。与取食玉米籽粒的草地贪夜蛾相比,取食烟草叶片的个体适合度显著降低,但成虫配对后能够产卵并孵化出幼虫。与非嗜好寄主烟草相比,草地贪夜蛾取食嗜好寄主玉米表现出更高的适合度,其偏好选择玉米进行产卵和取食,但在烟草上也能完成生活史,种群密度大时存在为害烟草的潜在风险。     

1994—2009年我国部分地区37株鸡传染性支气管炎病毒S蛋白基因序列分析

对自1994—2009年从我国5省区免疫鸡群中分离到的37株传染性支气管炎病毒(IBV)的S蛋白基因序列进行分析,发现S1基因序列存在广泛的氨基酸替换、缺失和插入现象,大部分IBV分离株S1基因的推导氨基酸序列变异主要集中在60～63、73～74、97、128、282～299位等。S2基因较为保守,主要在裂解位点后的2～47、122～152位发生氨基酸的替换,可见IBV S基因的不断变异可能是造成本试验所调查的5省区免疫鸡群IB频发的重要原因。遗传进化分析发现本试验所调查地区近十多年来肾型毒株仍是主要流行株,没有或少有4/91型毒株流行。所调研地区鸡的腺胃炎持续广泛地发生,但是从临床腺胃病料中很少分离到IBV,可见IBV不太可能是引起腺胃炎的主要病原。     

基于MATLAB实现模糊神经网络模型在企业水环境中的应用

指出了水质评价是进行水环境容量计算和实施水污染控制规划的重要基础。应用模糊神经网络原理，以某企业污水处理站的检验数据为依据，选择3个评价参数，使用MATLAB函数工具箱编程，建立了T—S模型，经过仿真得出评价结果，研究表明：该方法能正确评价水质的样本，具有较好地客观性和预测性。     

烟草嫁接苗对黑胫病的抗性鉴定

嫁接技术是植物病害绿色防控的有效措施之一,为探寻抗烟草黑胫病的高抗嫁接组合,本研究以4个高抗烟草品种为砧木,生产上4个主栽品种为接穗,开展了不同嫁接组合烟苗对黑胫病的抗性鉴定。人工接种黑胫病菌后,以‘Florida 301’作砧木时烟苗发病率和病情指数分别为0~4.76%和0~2.86;以‘革新3号’作砧木时分别为0~20.71%和0~15.72;以‘Beinhart 1000-1’作砧木时分别为1.11%~13.18%和1.11~11.47;以‘L8’作砧木时分别为20.02%~65.33%和13.58~60.89,而以接穗品种‘K326’、‘云烟87’、‘NC55’和‘红花大金元’自根苗的发病率和病情指数分别为:‘K326’,39.98%和35.46,‘云烟87’,45.81%和39.18,‘NC55’39.33%和35.93,‘红花大金元’,74.67%和65.48。统计分析结果表明,以‘Florida 301’、‘革新3号’和‘Beinhart 1000-1’品种为砧木的嫁接苗发病率与病情指数均极显著低于接穗品种自根苗(P0.01);‘L8’品种为砧木时,只有‘云烟87’作接穗的发病率与病情指数极显著低于‘云烟87’自根苗(P0.01)。采用平板涂布计数法,对抗、感黑胫病烟草品种根际微生物数量进行了测定,研究了抗、感病品种根际微生物群落结构,结果表明,抗、感病品种均是根际细菌根际放线菌根际真菌,且根际细菌、放线菌数量远多于真菌数量,抗病品种的根际微生物数量整体上多于感病品种。     

烟草PR10蛋白生物活性及赤星病菌Alternaria alternata诱导下的表达分析

为深入研究植物PR10蛋白的生物学功能,以烟草PR10蛋白(NtPR10)为研究对象,采用冷休克蛋白表达载体p Cold II,构建烟草PR10融合蛋白原核表达系统,优化表达及纯化条件,获得高纯度NtPR10融合蛋白;分别采用底物法和滤纸片法体外分析其核酸酶活性及抑菌活性;并利用荧光定量PCR方法分析了烟草赤星病菌Alternaria alternata侵染下,NtPR10基因在抗、感烟草品种内不同时间点的表达差异。结果表明,15℃、0.1 mmol/L IPTG过夜条件下可诱导获得大量可溶性目的蛋白,50、100 mmol/L咪唑缓冲液洗脱能够获得较高纯度的目的蛋白;纯化后的NtPR10蛋白能够降解烟草总RNA,具有核酸酶活性,且1.0、0.5、0.25μg/μL的NtPR10蛋白溶液均对烟草赤星病菌的菌丝生长具有显著的抑制作用,但随着蛋白浓度的降低,抑菌作用减弱;荧光定量PCR结果显示,接种烟草赤星病菌后,NtPR10基因在感病品种和抗病品种中均显著上调表达,但其在抗病品种的响应速度和表达量显著高于感病品种,表明NtPR10应答了烟草赤星病菌的侵染过程。     

生地黄提取物的制备及其卷烟应用

为开发新型天然烟用香料,采用热回流提取工艺制备生地黄提取物。以提取物得率、感官品质为评价指标,利用单因素试验结合Box-Behnken响应面分析方法对热回流提取工艺中关键参数进行优化,并对其在卷烟中的应用效果进行评价。结果表明,最佳提取工艺条件为提取温度85℃,提取时间55 min,提取溶剂为50%乙醇,料液比1∶12,此时提取物得率为42.0%,且添加量为0.1%~0.4%时感官品质最佳,可丰富烟香,改善余味,增甜增润。     

烟草NbbZIP28突变体的创建及其对病毒侵染胁迫的响应

【目的】bZIP类转录因子参与植物的生长发育、激素信号、抗病性及抗逆性等多种生物胁迫过程。前期研究表明黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)或烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)侵染本氏烟(Nicotiana benthamiana)上调内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERs）因子NbbZIP28;NbbZIP28沉默导致病毒积累量上升,本研究旨在验证NbbZIP28对病毒侵染胁迫的响应机制。【方法】通过CRISPR/Cas9基因编辑技术和烟草遗传转染创建NbbZIP28基因突变植株,以野生型植株为对照,分别浸润接种侵染性克隆TMV-GFP、摩擦接种TMV-GFP或CMV接种液,检测突变体植株对病毒侵染胁迫的敏感性变化,接种CMV后0-48 h,采用qRT-PCR检测内质网应激相关的未折叠蛋白反应（unfolded protein response,UPR)基因的表达。本氏烟接种TMV 24 h、接种CMV 48 h后,在接种叶上浸润融合蛋白NbbZIP28-GFP,瞬时表达48 h后,采用Western blot检测病毒诱导NbbZIP28蛋白的水解激活;采用在线搜索工具PlantCARE分析NbbZIP28启动子区域中参与防卫和应激反应的顺式作用元件。【结果】CRISPR/Cas9定点敲除NbbZIP28后,目的基因靶位点缺失了10个碱基,导致翻译错误、蛋白功能变化。在正常生长条件下,转基因阳性植株与野生型无显著的表型差异。植株接种TMV-GFP后4-8 d,突变体中的病毒浸润斑亮度或初侵染点数目均显著高于野生型,扩展至新叶的速度较快。接种CMV后12-48 h,突变体中UPR相关基因BiP、PDI、CAM及NbbZIP28下游基因NF-YC2的表达量显著低于野生型;5-7 d突变体中的病毒外壳蛋白（coat protein,CP）基因表达量显著高于野生型,花叶及皱缩症状更显著。蛋白质序列比对分析显示NbbZIP28具有与拟南芥AtbZIP28相同的S1P和S2P蛋白酶水解位点。Western blot检测发现,与接种清水对照相比,TMV或CMV侵染显著促进了全长的融合蛋白NbbZIP28-GFP在S1P和S2P位点发生裂解。NbbZIP28启动子序列中包含5个参与热应激反应的顺式作用元件（heat stress response element,HSE）、3个参与低温反应的顺式作用元件（low temperature response element,LTR）、1个参与防卫和应激反应的顺式作用元件（TC-rich repeats）。【结论】病毒侵染促进NbbZIP28的水解激活并上调相关的UPR基因;NbbZIP28敲除导致植株对病毒的敏感性上升,病毒诱导的UPR基因表达被抑制。NbbZIP28为病毒侵染胁迫下的UPR调控因子,在病毒侵染早期通过上调UPR信号和提高寄主基础防卫反应而延缓病毒的侵染和增殖。