“细菌型”pepc2基因反向表达载体构建及在莱茵衣藻中的表达

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC, EC 4.1.1.31)在植物碳代谢中处于代谢纽的关键位置,是调节细胞蛋白质和脂肪酸含量的关键酶,通过抑制pepc基因的表达,可以提高细胞的含油率。通过克隆莱茵衣藻“细菌型”pepc2/基因的部分序列（简称Crpepc2）和莱茵衣藻融合启动子Hsp70A RBCS2（简称HR）,将HR和Crpepc2片段插入pSP124s中,获得Crpepc2反向表达的莱茵衣藻高效表达载体pSP124s-HR-reve-Crpepc2-。利用基因枪将pSP24s和pSP124s-HR-reve-Crpepc2分别转入莱茵衣藻cc 503藻株,得到空质粒型和反向型突变藻株。利用qPCR检测莱茵衣藻野生型、空质粒型和反向型藻株“细菌型”pepc2/基因的相对表达量,结果表明空质粒的导入对莱茵衣藻pepc2/基因的相对表达量影响很小,为野生型的92.95%;而反向型pepc2/基因的导入明显降低了莱茵衣藻pepc2/基因的相对表达量,仅为野生型的2.94%。该结果一方面说明我们建立了利用qPCR快速检测莱茵衣藻pepc2/基因相对表达量的方法,另一方面也证明利用Crpepc2反向表达的方法（即“反向载体技术”）可以有效的抑制莱茵衣藻pepc2/基因的表达,为进一步筛选稳定的含油量高的藻株奠定了良好的基础。     

白斑综合征病毒(WSSV)基因VP28原核表达与检测

VP28是对虾白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)的囊膜蛋白.将VP28基因序列密码子优化后合成,经限制性内切酶NdeⅠ、Xho Ⅰ酶切后,按正确的阅读框顺序插入到pET-28a(+)表达载体上.重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经质粒双酶切、测序鉴定后成功地构建了VP28基因原核表达载体pET-28a-VP28.转化菌经IPTG诱导,SDS-PAGE显示含有与预期大小一致的约30 ku蛋白带,主要以包涵体形式表达.采用Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,获得了纯度为95％的大肠杆菌重组蛋白VP28.该纯化蛋白作为绝对定量Western的标准品,梯度稀释建立标准曲线,以定量检测转基因鱼腥藻7120中的VP28绝对表达量.实验结果表明,大肠杆菌BL21(DE3)表达的重组蛋白VP28与鱼腥藻7120中表达的VP28分子量基本相同,纯化后的大肠杆菌重组蛋白梯度稀释作为绝对定量Western标准曲线,计算出转基因鱼腥藻7120在培养第17天时,VP28的表达量最大,为5.14 μg/mL,占转基因鱼腥藻7120总蛋白浓度的1.45％.这不仅对转基因鱼腥藻的高效培养具有重要意义,也为日后确定投喂对虾口服疫苗有效剂量防治白斑综合征奠定了基础.     

莱茵衣藻“细菌型”pepc2基因叶绿体表达及其对油脂蛋白质含量的影响

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC,EC 4.1.1.31)在植物碳代谢中有重要作用,高等植物中PEPC可以调控蛋白质和脂肪酸含量,但是对绿藻PEPC的研究还较少.莱茵衣藻是绿藻中的模式生物,其基因工程中外源基因的转化以叶绿体转化效率最高,为了提高外源蛋白表达和获得高产油莱茵衣藻,利用叶绿体转化法能进一步提高表达效率.因此,本研究首先克隆了莱茵衣藻“细菌型”PEPCCS Ⅰ (conserved sequence Ⅰ)的639 bp,构建了pASapI-reve-Crpepc2和pASapI-forw-Crpepc2正反向叶绿体表达载体,并用基因枪法转化莱茵衣藻cc-400获得了空质粒型,正向型和反向型转基因藻株.其次,应用RT-qPCR方法检测Crpepc2的相对表达量,结果表明反向型Crpepc2的表达量减少了89.97％,而正向型增加了201.16％.最后,检测了总蛋白和脂质含量的变化,正向型突变株的总蛋白增加了37.03％;而反向型突变株的脂质含量增加了70.32％,且不饱和脂肪酸含量明显增加.以上结果证明莱茵衣藻“细菌型”PEPC的叶绿体表达不仅可以进一步提高蛋白质与脂肪酸含量,也可为今后外源蛋白的表达和高产油工程藻的应用做贡献.     

莱茵衣藻“细菌型”pepc2基因叶绿体表达及其对油脂蛋白质含量的影响

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（Phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC,EC 4.1.1.31）在植物碳代谢中有重要作用,高等植物中PEPC可以调控蛋白质和脂肪酸含量,但是对绿藻PEPC的研究还较少。莱茵衣藻是绿藻中的模式生物,其基因工程中外源基因的转化以叶绿体转化效率最高,为了提高外源蛋白表达和获得高产油莱茵衣藻,利用叶绿体转化法能进一步提高表达效率。因此,本研究首先克隆了莱茵衣藻“细菌型”PEPCCSⅠ（conserved sequenceⅠ）的639 bp,构建了pASapI-reve-Crpepc2和pASapI-forw-Crpepc2正反向叶绿体表达载体,并用基因枪法转化莱茵衣藻cc-400获得了空质粒型,正向型和反向型转基因藻株。其次,应用RT-qPCR方法检测Crpepc2的相对表达量,结果表明反向型Crpepc2的表达量减少了89.97%,而正向型增加了201.16%。最后,检测了总蛋白和脂质含量的变化,正向型突变株的总蛋白增加了37.03%;而反向型突变株的脂质含量增加了70.32%,且不饱和脂肪酸含量明显增加。以上结果证明莱茵衣藻“细菌型”PEPC的叶绿体表达不仅可以进一步提高蛋白质与脂肪酸含量,也可为今后外源蛋白的表达和高产油工程藻的应用做贡献。     

“ 细菌型”pepc2基因反向表达载体构建及在莱茵衣藻中表达

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC, EC 4.1.1.31)在植物碳代谢中处于代谢纽的关键位置,是调节细胞蛋白质和脂肪酸含量的关键酶,通过抑制pepc基因的表达,可以提高细胞的含油率。通过克隆莱茵衣藻“细菌型”pepc2基因的部分序列（简称Crpepc2）和莱茵衣藻融合启动子Hsp70A-RBCS2（简称HR）,将HR和Crpepc2片段插入pSP124s中,获得Crpepc2反向表达的莱茵衣藻高效表达载体pSP124s-HR-reve- Crpepc2。利用基因枪将pSP24s和pSP124s-HR-reve-Crpepc2分别转入莱茵衣藻cc-503藻株,得到空质粒型和反向型突变藻株。利用qPCR检测莱茵衣藻野生型、空质粒型和反向型藻株“细菌型”pepc2基因的相对表达量,结果表明空质粒的导入对莱茵衣藻pepc2基因的相对表达量影响很小,为野生型的92.95%;而反向型pepc2基因的导入明显降低了莱茵衣藻pepc2基因的相对表达量,仅为野生型的2.94%。该结果一方面说明我们建立了利用qPCR快速检测莱茵衣藻pepc2基因相对表达量的方法,另一方面也证明利用Crpepc2反向表达的方法（即“反向载体技术”）可以有效的抑制莱茵衣藻pepc2基因的表达,为进一步筛选稳定的含油量高的藻株奠定了良好的基础。     

白斑综合征病毒(WSSV)基因VP28原核表达与检测

VP28是对虾白斑综合症病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV) 的囊膜蛋白。将VP28基因序列密码子优化后合成,经限制性内切酶Nde I、Xho I酶切后,按正确的阅读框顺序插入到pET-28a( )表达载体上。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经质粒双酶切、测序鉴定后,证实成功地构建了 VP28 基因原核表达载体pET-28a-VP28。转化菌经 IPTG 诱导,SDS-PAGE 显示含有与预期大小一致的约30kDa蛋白带,主要以包涵体形式表达。采用Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,获得了纯度为95%的大肠杆菌重组蛋白VP28。该纯化蛋白作为绝对定量Western的标准品,梯度稀释建立标准曲线,以定量检测转基因鱼腥藻7120中的VP28绝对表达量。实验结果表明,大肠杆菌BL21(DE3)表达的重组蛋白VP28与鱼腥藻7120中表达的VP28分子量基本相同,纯化后的大肠杆菌重组蛋白梯度稀释作为绝对定量Western标准曲线,计算出转基因鱼腥藻7120在培养第17天时,VP28的表达量最大,为5.14μg/mL,占转基因鱼腥藻7120总蛋白浓度的1.45%。这不仅对转基因鱼腥藻的高效培养具有重要意义,也为日后确定投喂对虾口服疫苗有效剂量防治白斑综合症奠定了基础。     

对虾白斑综合征病毒免疫防治研究进展

对虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是一种引起养殖对虾爆发性死亡的病毒,由于它宿主范围广、蔓延速度快以及致死率高,已经成为对虾养殖中的第一杀手,因此有效防治WSSV爆发在水产养殖中具有重要意义并极具挑战性。本文主要介绍WSSV基因组以及结构蛋白、对虾WSSV免疫机制、对虾WSSV疫苗研究进展,以及我国对虾养殖中WSSV防治措施,认为对虾WSSV疫苗将是今后对虾大规模养殖中病害防治的一种重要手段。     

转基因及相关亚品系鱼腥藻的纯化

转基因蓝藻纯化是研究其生理、生化、分子生物学、营养学、药理学、毒理学等必不可少的环节,更是其作为生产原料的基础。传统纯化方法仅对不同物种间的分离进行了讨论,尚未涉及野生藻种和转基因突变株在实验和生产中相互污染情况下的鉴别和分离。本文的转基因藻纯化方法先后从种群、细胞、分子3个层面纯化分离了藻种。该方法使用平板划线的方法将杂藻杂菌与鱼腥藻分离,再使用核酸电泳、RT-qPCR、Western Blot将鱼腥藻野生种、转空载体突变株以及转目的基因突变株3个亚品系逐步分离。纯化分离后的藻株生长速率得到了提高,目的基因的表达效率增长,生产目的蛋白的产率自然增长。本研究对转基因藻在实验和生产中出现的一些问题提出了相应的解决方案,对转基因微藻的应用具有积极的作用。