麦洼牦牛TLR1基因组织表达分析

【目的】建立一种牦牛TLR1基因表达量的荧光定量PCR检测方法,并分析TLR1基因在牦牛不同组织中的表达差异。【方法】参考牦牛TLR1基因序列,在其保守区设计特异性引物,并以牦牛β-actin基因为内参基因建立荧光定量方法;基于该荧光定量方法分析TLR1基因在牦牛心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、胃、乳腺、肌肉、卵巢11种组织中的表达水平。【结果】TLR1基因和β-actin基因扩增产物电泳结果呈现单一条带,其产物熔解曲线均为特异的单峰,表明引物具有较高的特异性。组织表达结果显示,TLR1基因在所检测的牦牛11个组织样本中均有表达,其中在肾、肝、脾、肺、卵巢、小肠中表达量较高,在胃、乳腺、心、大肠、肌肉组织中表达量较低。【结论】TLR1基因在牦牛各组织中转录水平差异较大,这可能与各组织对病原体的识别和抵抗能力有关。     

麦洼牦牛Toll样受体1基因的克隆及生物信息学分析

【目的】克隆并分析高原牦牛Toll样受体1基因(TLR1)的特点。【方法】提取麦洼牦牛脾脏RNA,反转录合成cDNA,以其为模板分段扩增后拼接获得麦洼牦牛TLR1基因编码区序列,采用相关分析软件对基因进行序列分析,并对其编码的蛋白质进行基本理化性质分析及预测。【结果】分段扩增获得了TLR1基因1 484bp的上游序列和823bp的下游序列,拼接后获得2 287bp的cDNA序列。TLR1基因系统进化树及同源性比对结果表明,TLR1基因极其保守,牦牛TLR1基因与黄牛、绵羊等哺乳动物遗传距离很近。预测TLR1基因含有1个2 184bp的开放阅读框,编码727个氨基酸,其编码蛋白的分子质量为83.148 7ku;预测TLR1蛋白在第500~600位氨基酸区域含有1个疏水区域,结合跨膜区预测认为该疏水区域可能是TLR1蛋白的一个跨膜区,TLR1蛋白二级结构主要以α-螺旋及自由卷曲为主。【结论】TLR1基因在高原牦牛与平原哺乳动物之间存在较高的同源性,这可能与TLR1蛋白重要的生理功能相关。     

牦牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因的克隆及序列分析

为了解牦牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因的特点,根据GenBank已公布的牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因序列设计4对引物,每个基因分两段扩增,测序并拼接,首次克隆牦牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因。序列分析表明,扩增到的牦牛应激型 HSPA1A基因全长2 134 bp,开放阅读框全长1 926 bp,编码641个氨基酸,分子质量为70.26 ku; HSPA2基因全长1 911 bp,开放阅读框全长1 911 bp,编码636个氨基酸,分子质量为69.85 ku。将 HSPA1A和 HSPA2基因开放阅读框编码的氨基酸序列进行ScanProsite分析,均得到3个HSP70蛋白家族标记。核苷酸序列同源性分析表明, HSPA1A和 HSPA2基因具有较高的保守性,牦牛与牛的 HSPA1A和 HSPA2基因核苷酸序列同源性最高,分别为99.8%和99.1%。遗传进化关系分析表明,牦牛与牛的应激型 HSPA1A和 HSPA2基因亲缘关系最近。     

牦牛Toll样受体5基因的克隆及序列分析

根据GenBank中已公布牛Toll样受体5（toll-like receptors 5,TLR5）基因序列,设计全长引物,并对所得序列进行生物信息学分析和预测。基因序列分析结果表明,克隆得到牦牛TLR5基因全长2582 bp,开放阅读框2577 bp,编码氨基酸858个,N端含有21个氨基酸组成的信号肽,分子质量为97.981 ku,理论等电点为4.85;蛋白预测结果表明,TLR5编码蛋白整体表现为亲水性;同源性分析结果表明,牦牛与野牦牛、黄牛、绵羊、山羊等物种具有较高的同源性,在系统发育树中距离最近,说明TLR5基因序列具有较高的保守性。牦牛TLR5基因序列的成功克隆为今后深入研究牦牛及高原动物抗病及免疫机制提供非常重要的理论基础。     

牦牛TLR4基因的克隆测序及序列分析

旨在了解牦牛天然免疫受体TLR4基因特点。根据GenBank已公布的牛TLR4基因序列,分3段设计引物,测序、拼接克隆序列,并对所得序列进行生物信息学分析和预测。基因序列分析表明,克隆得到牦牛TLR4基因编码区全长2 807bp,开放阅读框2 526bp,编码氨基酸841个,N端含有27个氨基酸组成的信号肽,分子质量96.009 8ku,理论等电点为6.35。蛋白预测结果表明,TLR4编码蛋白整体表现为亲水性。同源性分析表明,10条序列当中牦牛与野牦牛、普通牛、绵羊等物种具有较高的同源性,在系统发育树中距离最近。说明TLR4基因序列具有较高的保守性。     

牦牛Toll样受体8和9基因克隆及组织表达分析

为了解牦牛Toll样受体8(TLR8)和9(TLR9)蛋白的结构特征及其基因的组织表达规律,丰富牦牛TLRs基因研究的理论数据,应用RT-PCR方法克隆牦牛TLR8、TLR9基因,并进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR技术构建组织表达谱。结果显示,两个基因cDNA全长分别为3 102bp和3 090bp。牦牛TLR8和TLR9基因与野牦牛、黄牛和绵羊之间的同源性都很高,均在95%以上。牦牛TLR8和TLR9蛋白都具有胞外LRRs功能域、胞内区TIR结构域、低复杂度区;另外,TLR8还具有1个C端富集亮氨酸重复序列(LRRCT)和跨膜结构域。两个基因在10个组织中均有不同程度的表达,在肾脏中表达量最高,而在大肠中表达量最低。本研究成功克隆了牦牛TLR8和TLR9基因的完整编码区,并揭示了它们在各组织器官的表达规律,为进一步研究TLRs在牦牛体内的免疫机制奠定了基础。     

16S rRNA高通量测序技术筛选牦牛瘤胃细菌基因组DNA提取方法及菌群结构

【目的】确定理想的牦牛瘤胃细菌基因组DNA提取方法及初步分析牦牛瘤胃细菌的群体结构。【方法】采用物理法(珠磨法、反复冻融法)、化学法(CTAB、SDS)及酶解法(溶菌酶、蛋白酶K)三者与瘤胃细菌特点相结合的方法,组合生成9种不同方法,即方法 1(CTAB+SDS+Lysozyme+无特殊物理处理法)、方法 2(CTAB+SDS+Lysozyme+反复冻融法)、方法 3(CTAB+SDS+Lysozyme+珠磨法)、方法 4(CTAB+Lysozyme+无特殊物理处理法)、方法 5(CTAB+Lysozyme+反复冻融法)、方法 6(CTAB+Lysozyme+珠磨法)、方法 7(SDS+Lysozyme+无特殊物理处理法)、方法 8(SDS+Lysozyme+反复冻融法)、方法 9(SDS+Lysozyme+珠磨法),同时以QIA amp DNA Stool Mini Kit(方法 10)为对照,以这10种方法来提取瘤胃微生物基因组DNA,并通过DNA浓度、纯度、DNA电泳图等基本性质及16S r RNA高通量测序结果对其进行分析比较,同时通过测序结果初步分析牦牛瘤胃细菌群体结构。【结果】不同DNA提取方法效率比对结果显示,同样的化学及生物酶裂解条件下,结合珠磨法及反复冻融法能够显著地增强细胞裂解效率,提高DNA产量。其中方法 3及方法 6提取的DNA具有较高的浓度及纯度,方法 7—10缺乏CTAB阳离子去污剂,提取的DNA量显著低于其他方法(P0.05),除方法 2和8所提取的样品经多次试验,PCR产物目的条带太弱或未检测到外,其余8种方法提取的样品PCR产物目的条带大小正确,浓度合适,符合高通量测序的要求。16S r RNA高通量测序共生成了191 349条原始数据,质控后得到有效序列171 231条。稀释性曲线分析表明,数据量合理并达到饱和,能够完整反映样品的菌群种类。OTU聚类数据统计、分类学和多样性指数分析显示方法 6和10包含的细菌较丰富。不同提取方法对革兰氏阳性菌提取效果比对结果表明方法 6裂解革兰氏阳性菌细胞壁的能力比其他方法相对较高。综上,方法 6(CTAB-Lysozyme-珠磨)提取的DNA产量、样品多样性指数及革兰氏阳性菌破壁能力均优于其他方法。菌群结构分析表明牦牛瘤胃细菌菌群结构包括21门、35纲、75科、112属,丰度较高的菌群依次是拟杆菌Bacteroidtes(64%)、厚壁菌Firmicutes(20%)、螺旋体Spirochaetae(2.3%)和变形菌Proteobacteri(1.8%),纤维杆菌Fibrobacter(1.7%)。牦牛瘤胃细菌群体结构与黄牛相比存在着一定的差异,这可能归因于饮食及环境的不同。【结论】利用16S r RNA高通量测序筛选出了牦牛瘤胃细菌基因组DNA理想提取方法,即方法 6(CTAB-Lysozyme-珠磨),并初步分析了牦牛瘤胃细菌群体结构,为研究牦牛瘤胃微生物群体特殊性及挖掘牦牛体内的基因资源奠定了基础。     

牦牛乳腺上皮细胞体外培养及鉴定

本研究旨在建立牦牛乳腺上皮细胞系,并对建立的细胞系生物学特性进行鉴定,采用组织块种植法,分离培养乳腺上皮细胞;通过胰酶消化法纯化细胞;利用免疫荧光及Western blot技术对其进行鉴定;脂质体介导法将绿色荧光蛋白基因转染进乳腺上皮细胞中,荧光显微镜下检测绿色荧光蛋白基因表达;金黄色葡萄球菌侵染牦牛乳腺上皮细胞,流式细胞仪(AnnexinV/PI双染法)检测乳腺上皮细胞的凋亡,RT-PCR检测感染细胞中抗菌肽以及凋亡因子表达。结果表明,分离纯化获得牦牛乳腺上皮细胞,细胞角蛋白18表达呈阳性,波形蛋白表达呈阴性,证明培养的细胞是上皮细胞并且没有成纤维细胞污染;β-酪蛋白表达呈阳性,说明建立的乳腺上皮细胞具有一定的泌乳功能;荧光显微镜能够检测到绿色荧光蛋白表达,表明EGFP基因成功导入了乳腺上皮细胞;金黄色葡萄球菌感染牦牛乳腺上皮细胞3h后,Annexin V/PI双染法检测发现感染组细胞凋亡率明显升高,差异显著(P0.05);感染细胞中TAP(P0.01)、BNBD5(P0.01)及BAX(P0.01)表达量明显增高,BCL-2(P0.05)表达量降低。综上表明,本研究成功建立了一株稳定的牦牛乳腺上皮细胞系,该细胞系能够作为研究牦牛乳腺发育及分化的体外研究模型。