刺糖多孢菌鼠李糖和福乐糖胺合成基因的克隆和组装

鼠李糖和福乐糖胺是多杀菌素生物合成必需的2个脱氧糖结构单元,负责其合成的4种酶的基因(gtt、epi、gdh、kre)与多杀菌素生物合成基因簇并不在一起,而是分散分布在染色体的3个位点上。为克隆到完整的多杀菌素生物合成基因簇,采用构建基因组文库、PCR扩增等手段从刺糖多孢菌NRRL18395染色体分别克隆gtt、epi、gdh和kre基因,并将其克隆组装在同一整合型载体上,以便于构建用于表达多杀菌素糖单元合成基因的表达载体。     

大肠杆菌乙酰-CoA羧化酶基因异源表达对变铅青链霉菌次级代谢的影响

克隆组装了大肠杆菌的乙酰-CoA羧化酶基因acc,以研究其异源表达对变铅青链霉菌中2种“沉默”抗生素放线紫红素和十一烷基灵菌红素合成的影响。大肠杆菌ACC由4个基因编码,通过PCR扩增4个基因,并通过重叠延伸PCR加上ermE启动子,构建得到4个重组基因;再将重组基因依次组装得到异源表达质粒pHLZ11,接合转移到变铅青链霉菌中进行异源表达。结果显示：含有异源表达质粒的变铅青链霉菌接合转移子能合成放线紫红素而十一烷基灵菌红素产量提高。表明大肠杆菌acc基因异源表达能够激活变铅青链霉菌沉默抗生素的合成,并提高已有抗生素产量。     

变铅青链霉菌高效异源表达宿主SBT5的构建

以变铅青链霉菌TK24为出发菌株,依次敲除钙依赖抗生素(CDA)、放线紫红素(ACT)和十一烷基灵菌红素(RED)这3个内源抗生素的生物合成基因簇,同时在钙依赖抗生素基因簇原位整合了来自棒状链霉菌的全局性调控基因afsRScla,构建得到变铅青链霉菌菌株SBT5。将来自天蓝色链霉菌的放线紫红素生物合成基因簇导入SBT5中,接合子产生大量蓝色的放线紫红素,而出发菌株TK24只产微量蓝色抗生素;SBT5接合子的ACT产量也显著高于导入了额外act基因簇拷贝的出发菌株接合子。SBT5菌株次级代谢背景清晰,不产色素类抗生素和抗细菌抗生素,可作为高效宿主用于次级代谢产物基因簇的异源表达和筛选。     

链丝菌素生物合成基因簇的克隆及其异源表达

通过基因组粘粒文库的高通量接合转移、异源表达和生物活性测定,结合DNA序列测定,从刺孢吸水链霉菌AA97026中筛选具有广谱抗菌活性的小分子化合物及其生物合成基因簇,获得1个对革兰氏阳性细菌和红酵母均有抑制活性的阳性克隆1H5,其部分DNA序列与链丝菌素生物合成基因相似。含1H5的异源链霉菌宿主的发酵液均能检测到链丝菌素的不同组份,表明1H5含有完整的链丝菌素生物合成基因簇。