应用TaqMan-MGB探针进行松材线虫的实时荧光定量检测技术研究

 松材线虫是国际公认的最重要的检疫性有害生物之一,也是我国2类检疫危险性有害生物,我国口岸多次从货物的木质包装中截获该线虫。由于松材线虫与拟松材线虫在形态上极其相似,难以区分,幼虫更无法用于鉴定。传统的形态学鉴定、生化以及其他分子技术等方法存在费时、准确度不高、灵敏度低等缺点,不易形成标准。我们设计筛选一对引物以及一条MGB探针,对松材线虫进行实时荧光PCR检测。建立了一条从1 pg到10⁴pg标准曲线,相关系数r=0.965。该检测方法省时、准确、快速、无污染。     

长蒴母草黄脉病毒——一个双生病毒的新种

 从采集于海南儋州地区表现黄脉症状的长蒴母草(Lindernia anagallis)上分离到病毒分离物L2, DNA-A全序列分析结果表明, 全长2739个核苷酸(nt)(GenBank登录号:AY795900), 共编码6个ORF, 其中病毒链编码AV1(CP)、AV2, 互补链编码AC1、AC2、AC3、AC4。利用BLAST程序对DNA-A进行分析表明, 与L2 DNA-A有同源关系的病毒均为双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色黄花叶病毒属(Begomovirus)成员。进一步比较发现, L2 DNA-A与我国广东报道的广东番茄曲叶病毒(Tomato leaf curl Guangdong virus, ToLCGuV)(AY602165)全基因组核苷酸序列的同源性最近, 仅为77.0%, 说明L2为Begomovirus中的一个新种, 命名为长蒴母草黄脉病毒(Lindernia anagallis yellow vein virus, LAYVV)。与L2的IR区及各基因编码的氨基酸序列有最高同源性的病毒均来源于亚洲。利用DNA-B特异引物和DNA-β的特异引物, 均未检测到DNA-B和卫星DNA-β的存在。     

橡胶树抗病相关基因HbNPR1的克隆及其表达分析

前期利用cDNA-AFLP技术分离获得了一个与橡胶树抗棒孢霉落叶病反应相关的差异表达基因片段EST-IAN-188,通过Blast比对分析发现,该基因片段与植物抗病相关NPR基因家族中的NPR1具有高度的同源性。将该片段与橡胶树基因组序列进行比对,设计引物进行PCR扩增,得到了一个橡胶树NPR1基因的cDNA和基因组序列,命名为HbNPR1基因。基因序列分析显示,该基因编码区全长(CDS)1 374 nt,含有两个外显子和一个内含子,编码457个氨基酸,蛋白分子量为51.0 ku,等电点5.82,具有BTB/POZ、ANK锚蛋白重复序列、DUF和NPR1-like C等4个结构域。qRT-PCR定量分析发现,HbNPR1基因在橡胶叶片中的表达丰度最高,特别是古铜期叶片;多主棒孢病菌(Corynespora cassiicola)诱导下HbNPR1基因在抗病品种(IAN873)的表达丰度明显高于感病品种(PR107);另外,SA、MeJA、ET处理下均能诱导HbNPR1基因的表达,SA处理后的表达量丰度最高。本研究初步表明,HbNPR1基因可能参与橡胶树抗病信号途径的调控和寄主对病原菌侵染的防御反应。     

我国热带作物多主棒孢种群多样性及致病力分化分析

多主棒孢（Corynespora cassiicola）是一种全球分布的重要植物病原真菌,寄主范围十分广泛。近年来,该病原菌侵染危害多种热带作物,并在局部地区大面积暴发流行,造成巨大的经济损失。本研究利用核糖体转录间隔区（Internal transcribed spacer, ITS）、翻译延伸因子（translation elongation factor 1 alpha, EF-1α）、β微管蛋白（β-Tubulin, TUB）,对来自橡胶树、木薯、番木瓜和瓜菜等多种热带作物的70株多主棒孢进行种群多样性分析。结果发现,利用最大似然法,在相似系数为0.97时可将供试菌株划分为两大遗传类群：类群Ⅰ为国内和一些国外橡胶树的多主棒孢;类群Ⅱ为其他寄主多主棒孢,遗传类群与寄主来源具有显著的相关性。致病力测定表明,多主棒孢种内致病力分化明显,类群Ⅰ的橡胶树多主棒孢仅能侵染橡胶树,不能侵染其他寄主,具有明显的寄主专化性,且不同地理来源的菌株致病力差异不显著。类群Ⅱ的多主棒孢在不同寄主间可以相互侵染,但菌株在致病力和发病症状上存在一定差异,表现出对其原寄主的高度致病力。多基因序列聚类分析与致病力分化分析结果具有较好的一致性,这为研究我国热带作物多主棒孢的种群结构、主要致病型以及为多主棒孢病害的发生、流行和防治提供了理论依据。     

一株拮抗香蕉枯萎病菌内生细菌的抑菌机制研究

采用生物化学方法,分析了一株香蕉内生细菌BEB99发酵液的乙酸乙酯粗提物对香蕉枯萎病菌4号小种(FOC4)的抑菌机制,结果表明,其对香蕉枯萎病菌菌丝脂质过氧化、麦角甾醇含量、蛋白质含量及果胶酶活性均有一定的影响,但不能产生几丁质酶。     

橡胶树类萌发素蛋白基因HbGLP01的克隆及其表达分析

类萌发素蛋白(GLPs)是一类重要的胁迫响应蛋白,参与植物的多种生理调控过程。试验前期通过cDNA-AFLP技术,从橡胶树转录组中筛选到一个与麻风树JcGLP(XM_012225699.1)高度同源的差异表达片段。在此基础上,通过基因预测和PCR扩增克隆到一个GLPs类基因HbGLP01。该基因包含2个外显子和1个内含子,cDNA全长696nt,编码231个氨基酸,预测蛋白分子量和等电点分别为24.8ku和5.54。同源比对表明,该蛋白与麻风树JcGLP1-13蛋白的同源性最高,达到81%。聚类分析研究表明,该蛋白与JcGLP1-13、胡杨PeGLP1-13及三角叶杨PtGLP等聚为一个分支。qRT-PCR分析发现,多主棒孢病菌侵染能诱导橡胶树HbGLP01基因的上调表达,其中高抗棒孢霉落叶病品种IAN873在侵染后24h时表达量达到峰值,高感品种PR107在48h后达到峰值,而且在IAN873中的表达峰值显著高于PR107。     

一株香蕉内生细菌挥发油成分及抑菌活性研究

测定一株香蕉内生细菌BEB99发酵液的石油醚和乙酸乙酯粗提物对香蕉枯萎病菌4号生理小种的(FOC4)菌丝生长和孢子萌发的影响,并测定粗提物中的主要成分。研究结果表明：其发酵液的石油醚和乙酸乙酯粗提物对香蕉枯萎病菌的菌丝生长和孢子萌发均具有明显抑制作用,可造成病菌菌丝的畸形,抗菌物质浓度为1.67 mg/mL时,其孢子萌发抑制率分别达到92.99%和82.96%。GC/MS分析从粗提物中鉴定到18个成分,其中主要成分包括油酸(14.98%)、油酸乙酯(11.38%)、亚麻油酸乙酯(14.86%)、亚油酸(13.20%)、棕榈酸(11.36%)和棕榈酸乙酯(11.26%),及一个未知化学成分。     

木薯新叶斑病病原鉴定及其生物学特性

2008和2009年在对木薯主产区病害的普查中,发现了一种新的叶斑病,命名为离孺孢叶斑病。形态观察结果表明,该病原菌分生孢子梗丛生,褐色,基细胞膨大呈半球形,成熟的分生孢子长椭圆形,两端钝圆,具5～8个隔膜,表明其为狗尾草离孺孢。ITS序列分析结果表明其和一株狗尾草离孺孢(EF452444)的序列同源性为99%。生物学特性研究结果表明,PDA培养基、28℃、pH7和光暗交替是菌落生长最适条件,D-葡萄糖和硝酸钠是其最适碳氮源,孢子萌发最适温度和致死温度分别为28℃和55℃5min。10种杀菌剂的室内筛选结果表明,咪鲜胺(25%咪鲜胺EC)的EC50值最小,抑菌效果最好。     

杂交竹枯萎病病情调查与病原鉴定

于2006和2008年在广西和江西等地的杂交竹枯萎病调查中,在11个地点发现了枯萎病并分离到病原菌。病原菌菌落圆形,分别为白色、粉红色或紫色,大分生孢子为镰刀形,小分生孢子肾形,厚垣孢子卵圆形。rDNA-ITS序列分析结果表明这些菌株和尖孢镰刀菌同源性在99%以上,确认这些病菌均为尖孢镰刀菌,为该病的有效防治提供了理论依据。     

橡胶树尖孢炭疽菌绿色荧光蛋白（GFP）标记转化株的获得

建立了根癌农杆菌介导转化橡胶树尖孢炭疽菌(Collectotrichum acutatum)获得T-DNA插入突变体的体系:在尖孢炭疽菌孢子浓度10~6个/mL、农杆菌浓度OD_(600)=0.15～0.2后在200μmol/mL的乙酰丁香酮(AS)诱导6 h,共培养48 h.转化效率可达150～300个/10~6个分生孢子.获得的转化子通过PCR检测绿色荧光蛋白基因、Southern 杂交验证、分生孢子的荧光观察,结果表明:被测转化子基因组中确实整合了目的片段,成功获得了橡胶树尖孢炭疽菌菌株CHY-1绿色荧光蛋白标记转化子.