人溶菌酶密码子优化及其在牛乳腺细胞中高效表达

【目的】分析牛乳腺中7种主要乳蛋白基因密码子使用偏好性,筛选高频密码子和低频密码子,依据其对人溶菌酶基因进行密码子局部优化和全局优化,通过牛乳腺上皮细胞等多种细胞对优化效果进行分析评价,为提高重组人溶菌酶表达量,开发新型、高效、安全的重组人溶菌酶提供理论依据。【方法】利用CodonW和EMBOSS等软件对7种主要牛乳蛋白和人溶菌酶基因密码子偏好进行生物信息学分析,筛选牛乳蛋白基因高频、低频密码子并根据牛乳蛋白基因密码子使用偏好对人溶菌酶基因翻译起始区前22位密码子（LYZop22）和全局密码子(LYZop)分别进行优化。构建人溶菌酶-荧光素酶融合表达载体（pGL3-LYZcw/op22/op）和人溶菌酶过表达载体（pcDNA-LYZcw/op22/op）,将上述载体分别转染牛乳腺上皮细胞(BMEC)、牛成纤维细胞（BFFC）和C127小鼠乳腺上皮细胞等3种细胞,通过荧光素酶、实时荧光定量PCR及Western-blot等方法检测密码子优化对溶菌酶表达的影响。【结果】牛乳蛋白基因密码子偏好以GC结尾,GC3s平均含量为0.537±0.062,而人溶菌酶GC3s含量为0.407,偏好以AT结尾;聚类结果表明,牛乳中酪蛋白与乳清蛋白类基因在密码子使用偏好性上也存在一定差异。依据筛选获得的牛主要乳蛋白基因5个高频密码子（RSCU>1.5）和7个低频密码子（RSCU<0.5）对人溶菌酶基因密码子进行优化并转染多种细胞进行表达效果分析。荧光素酶分析发现,相比野生型溶菌酶密码子（LYZcw）,翻译起始区密码子优化类型LYZop22分别在BMEC、BFFC细胞中提高1.48倍（P<0.01）和1.30倍（P>0.05）;而全局密码子优化类型LYZop分别在BMEC、BFFC中提高2.2倍（P<0.01）和2.44倍（P<0.01）,说明密码子优化能明显提高人溶菌酶在多种细胞中表达量。实时荧光定量PCR结果表明,LYZop22相比LYZcw在BMEC和BFFC细胞中分别提高了2.08倍（P<0.05）和1.5倍（P>0.05）,而LYZop则分别提高了22倍（P<0.01）和17.8倍（P<0.01）,mRNA表达水平与密码子优化后的mRNA二级结构稳定性呈正相关。Western-blot结果也进一步表明,密码子优化后的LYZop22和LYZop能明显提高重组人溶菌酶在牛乳腺上皮细胞中的表达量。上述结果表明,根据牛乳腺中主要乳蛋白基因密码子使用偏好进行密码子优化,能显著提高人溶菌酶在牛乳腺上皮细胞及成纤维细胞中的表达量,且溶菌酶基因全局密码子优化效果优于翻译起始区密码子优化效果。【结论】通过生物信息学分析获得了牛乳蛋白基因使密码子使用偏好及高低频密码子;依据牛乳蛋白密码子使用偏好性对人溶菌酶密码子优化能显著提高重组人溶菌酶mRNA水平和蛋白水平的表达量,为今后利用生物反应器高效生产重组人溶菌酶奠定基础。     

一例猪流行性腹泻病毒与猪肠道病毒9型、猪嵴病毒混合感染的诊断与分析

2018年初崇左市某家庭式养猪场发生腹泻疫情,初生仔猪水样腹泻,呕吐,脱水,消瘦,形成僵猪,大量死亡。为调查此次疫情发生的原因,试验通过临床剖检和实验室PCR/RT-PCR检测来进行分析。结果表明:临床剖检病变主要集中在小肠部位,肠系膜淋巴结肿大、充血,肠壁变薄。实验室检测发现存在猪流行性腹泻病毒、猪肠道病毒9型和猪嵴病毒的混合感染。结合本病例的流行病学数据、剖检病变及实验室检测结果,认为此次疫情主要由猪流行性腹泻病毒感染引起,部分病猪同时还感染猪肠道病毒9型和猪嵴病毒。说明应加强生物安全和提高仔猪免疫力以预防仔猪腹泻。     

布顿大麦TB1基因的克隆及内生真菌对其表达量的影响

分蘖生长在茎基部不伸长的节间，有不定根，能独立于主茎存活，禾本科作物布顿大麦主要通过分蘖来提高产量；内生真菌和基因均能调控布顿大麦分蘖，为了探究内生真菌对宿主植物分蘖相关基因TB1的影响，本研究利用RT-PCR法对布顿大麦TB1基因进行克隆并测序，采用生物信息学方法对该基因的序列结果进行分析，用SYBR Green荧光染料法对新疆温宿县和青海柴达木盆地带内生真菌（E+）和不带内生真菌（E-）的布顿大麦TB1基因进行q-PCR相对表达量分析。结果显示，克隆的TB1基因蛋白质编码区（CDS）全长为804 bp，编码267个氨基酸残基；TB1基因无启动子和PolyA位点；经亚细胞定位，TB1蛋白预计在液泡，TB1蛋白无跨膜结构域、无信号肽、不属于跨膜蛋白、存在于TCP家族；推测TB1蛋白为不稳定蛋白质。布顿大麦TB1基因与大麦亚种的TB1同源性最高，为96.72%，且与大麦亚种的TB1处于同一支系。温宿县和柴达木盆地布顿大麦根、茎、叶中TB1基因表达量趋势一致，内生真菌显著降低了植株分蘖发生部位茎基部的TB1基因表达量，表明内生真菌侵染影响了宿主TB1基因表达进而调控宿主植物分蘖。研究结果为...     

基于应用型国门高校实验实训室建设与管理的研究——以滇西边境高校为例

近年来,地方高校实现了转型发展,为地方经济社会发展做出了积极贡献。但在转型发展中,也折射出一些地方高校在管理方面存在的诸多问题。本文以滇西边境国门高校为探讨研究对象,以实验实训室建设与管理为切入点,针对存在的问题提出优化措施,以期为地方应用型高校实验实训室建设与管理模式的创新提供参考。     

农业人才实践技能的提升策略

随着经济全球化速度的加快,农业产业不断升级,新时代对农业人才质量的要求提高,培养高技能农业人才已成为一个世界性的话题。笔者结合云南省实际,分析了农业人才培养面临的机遇与挑战,从教学缺少创新性,校企合作对接不紧密,办学特色不突出3个方面探讨了农业人才培养的滞后性。重点论述了未来高技能农业人才培养途径,强调要以人为本,创新教学理念,建立完善的校企合作制度,突出本校办学特色,加强实验多学科交叉性与完整性,并采取全程导师制的教学模式。通过对农业人才实践技能提升策略的研究,期望能够对新型优质农业人才的培养建言献策。     

提高玉米杂交制种产量的配套技术

近年来,通过高产制种竞赛活动,出现了许多大面积创高产的典型,积累了丰富的经验。现结合部分高产制种经验,对提高玉米杂交制种产量的配套技术总结如下: 1 提高播种质量。首先,播前要进行晒种,种子要进行精选,有条件的要进行种子包衣。其次,要适期足墒播种,密度规格要一致,整地细致,施肥、开沟深浅、覆土厚薄要均匀,为种子发芽和幼苗生长创造良好的环境。 2 增加母本株数。 2.1 适当扩大行比。由于自交系株型紧凑,植株较     

低温弱光对西葫芦叶片解剖结构的影响

研究了不同温度和光照条件对西葫芦幼苗叶片解剖结构的影响。研究结果表明,低温弱光处理使得西葫芦叶片上下表皮细胞密度、细胞直径、气孔密度以及气孔长度均变小,叶片厚度变薄,栅栏组织厚度及叶片厚度均减小,海绵组织也变得更为疏松,栅栏组织/海绵组织的比值减小,细胞间隙变大。     

西葫芦叶片生长模拟模型的建立

以西葫芦幼苗为试材,采用麦夸迭代法研究西葫芦幼苗不同叶龄及不同节位叶面积生长发育的动态模型,结果表明,西葫芦幼苗叶面积的生长曲线均大致呈单“S”型.通过麦夸迭代法(Lev-enberg-Marquardt)+通用全局优化法进行优化,最终达到收敛时,西葫芦幼苗节位与叶面积相关系数为1,叶龄与叶面积相关系数为0.993.     

太原市城市水生态环境现状及保护措施

简要介绍了太原市的水系及水体状况,在分析水生态环境现状及其存在问题的基础上,提出了一系列保护措施,为进一步修复与建设太原市水生态环境奠定了坚实基础。