表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白基因的新城疫病毒感染性克隆的构建及病毒拯救

应用反向遗传技术对新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)LaSota株感染性克隆PBRN-FL质粒进行操作,构建插入欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)ORF5基因的重组质粒LaSota-ORF5并进行病毒拯救及鉴定。依据GenBank所发表的欧洲型PRRSV LV株ORF5序列,设计引物扩增ORF5片段,通过PBRN-FL质粒上P和M基因间的PmeⅠ酶切位点插入目的片段,构建重组质粒LaSota-ORF5。采用磷酸钙转染法将重组质粒和PCI-NP、PCI-P、PCI-L等3种辅助质粒共转染BSR-T7/5/细胞拯救病毒并对其分别进行RT-PCR、间接免疫荧光(IFA)和Western blot(WB)试验鉴定。结果显示:拯救病毒的RT-PCR产物测序结果正确,IFA出现绿色荧光,WB试验条带大小符合预期,证明GP5蛋白有效表达。结果表明:成功构建并拯救得到重组病毒rLaSota-GP5,为制备表达PRRSV GP5蛋白的重组NDV疫苗奠定基础。     

产紫丁香苷内生真菌CJ7的鉴定及发酵条件研究

为高效利用刺五加内生真菌资源,推动紫丁香苷的生产,采用HPLC法,以紫丁香苷为对照,分析内生真菌CJ7的次生代谢产物;采用琼脂糖扩散法,对内生真菌CJ7进行抑菌活性分析,并采用单因素实验及正交实验法对内生真菌CJ7发酵条件进行优选;采用形态学观察及ITS序列分析法对内生真菌CJ7进行菌种鉴定。结果表明,在内生真菌CJ7发酵液中含有紫丁香苷。抑菌活性实验结果表明,内生真菌CJ7对10种致病菌均有较好的抑制作用,尤其对金黄色葡萄球菌抑菌效果较为明显。经优化,CJ7的最佳发酵工艺为培养基中葡萄糖质量浓度2.5%,牛肉膏质量浓度2.0%,初始pH 7.0,装液量40%,接种量2%,培养8天,摇床转数120 r/min,发酵温度28℃。经鉴定,内生真菌CJ7为产烟曲霉(Aspergillus fumigatus)。上述研究说明,内生真菌CJ7为紫丁香苷产生菌。研究结果可为采用微生物发酵法生产紫丁香苷提供参考。     

猪细小病毒6型SYBR Green I real-time PCR检测方法的建立

采用PCR方法扩增PPV6保守区域基因252bp,将其克隆到pClon007载体,构建重组质粒作为标准阳性质粒。以质粒模板建立PPV6的SYBR GreenⅠreal-time PCR检测方法,并进行敏感性、特异性和重复性等验证。结果表明,重组质粒特异性好;建立的real-time PCR方法Ct值与标准品模板在8.80×109~8.80×101 copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.993,斜率为-4.320。该方法检测灵敏度可达8.80×101 copies/μL。该方法对JEV、PRV、PRRSV、PCV2、FMDV等猪常见病原检测均无特异性扩增;对临床样品的检测结果表明,所建立的荧光定量PCR阳性检测率为40.63%。本试验成功建立了PPV6SYBR Green I real-time PCR检测方法,可实现对PPV6快速灵敏的诊断。     

电子驻车制动系统

在对电子驻车制动系统的结构和工作原理进行分析的基础上,对电子驻车制动系统执行机构进行了动力学分析。从实际应用的角度出发,设计了一套电子驻车制动系统,该系统的中央控制器采用Philips592单片机,由同步带传动机构、少齿差行星齿轮传动机构和蜗杆传动机构组成的执行机构由直流电动机驱动,以达到实施或解除驻车制动的目的。针对某一具体车型,用台架实验验证了所设计的电子驻车制动系统的有效性。台架实验结果表明：电子驻车制动系统的静态特性和动态特性均满足理论计算要求。     

基于CRISPR/Cas9技术快速构建PRV gE基因缺失病毒

为快速、高效构建伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)糖蛋白E基因(gE)缺失病毒,基于CRISPR/Cas9基因编辑技术,首先将pSpCas9(BB)-2A-GFP荧光质粒转染至VERO细胞和PK-15细胞,选出转染效率较高的细胞系,同时于http://crispr.mit.edu/网站设计并合成3个高评分的小导向RNA(small guide RNA,sgRNA),通过噬斑形成试验,筛选出高效sgRNA。其次将筛选出的针对PRV gE基因的sgRNA转染于PK-15细胞,然后接种PRV-1病毒,经过5轮噬斑克隆纯化获得PRV-1-ΔgE。结果显示:VERO细胞比PK-15细胞具有更好的转染效果;gE-sgRNA1和gE-sgRNA2可作为针对gE基因的高效sgRNA;获得了1株PRV gE基因缺失291 bp的病毒,将其命名为PRV-1-ΔgE。研究表明,CRISPR/Cas9基因编辑技术可作为一种高效编辑PRV-1缺失病毒基因的方法,同时也为后续快速应对PRV变异株研究提供了新思路。     

生态源牌秸秆速腐剂堆腐效果初探

在麦秸秆（250kg)中加入1、2、3kg秸秆速腐剂堆沤肥料，试验结果表明：250kg秸秆用1kg速腐剂加2.5kg尿素堆腐比较经济。     

金刚烷胺抑制乙脑病毒感染引起小胶质细胞炎症反应的作用

目前金刚烷胺被(amantadine,Ama)用作一种抗病毒和抗帕金森药物,可抑制小胶质细胞的炎症激活。为验证金刚烷胺是否会抑制乙脑病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)感染小胶质细胞所引起的炎症反应,本试验利用Ama处理小鼠小胶质瘤BV-2细胞系后使用JEV感染细胞,测定细胞中炎性因子的表达,并与单独使用JEV处理BV-2细胞组进行对比分析。结果表明,Ama可以显著降低JEV感染引起的5种炎性因子的表达,MCP-1(62.17%)、IL-6(62.07%)、TNF-α(59.67%)、IL-1β(63.16%)以及IL-10(34.24%)。本试验为流行性乙型脑炎的临床治疗提供了理论依据。     

辽宁省本溪县富有矿银多金属矿床地质特征及成因浅析

富有银多金属矿矿体赋存于一条北东向断裂构造中，属热液充填交代型矿床，围岩主要为辽河群碳酸盐岩地层为主，围岩蚀变主要以硅化、碳酸盐化、石墨化、绿泥石化为主，黄铁矿化、绢云母化次之。成矿物质主要来自于辽河群大石桥组铅锌矿源层及断裂深部的岩浆热液。     

犬圆环病毒Cap蛋白的生物信息学分析及原核表达

犬圆环病毒(CanineCV)是近年被发现的圆环病毒属新成员,获取CaineCV Cap蛋白,为研究Cap蛋白的功能以及抗原表位奠定了基础。本研究以CaineCV GX2017株基因组作为模板,使用PCR方法扩增出Cap蛋白的基因序列,对其进行生物信息学分析,并克隆至pET-28a原,进行原核表达。结果表明:GX2017的N端2~26位氨基酸存在一个核定位信号,同时含有3个B细胞表位(aa7~aa14;aa150~aa174;aa233~aa253);第134位氨基酸为N-糖基化位点,第169和第238位氨基酸为O-型糖基化位点;进化分析表明,本研究的CanineCV Cap蛋白基因序列与欧美株同源性较低,且处在不同的分支;SDS-PAGE结果显示,重组Cap蛋白在E.coli BL21(DE3)中不能正确表达,切除了NLS的d(1-26)Cap蛋白能在E.coli BL21(DE3)中大量表达;Western blot 分析表明,该重组蛋白能与Anti-His 标签抗体发生特异性反应。本研究成功构建了pET-d(1-26)Cap重组原核表达质粒,并在大肠杆菌中获得高水平表达,为进一步制备Cap蛋白的抗体奠定了基础。     

半挂汽车列车模型的建立与试验

在建立8自由度半挂汽车列车数学模型的基础上,应用Matlab/Simulink仿真软件建立仿真模型.研制了能通过配重实现不同质量参数组合的挂车,并以优尼柯NJ1020型为牵引车,参考ISO9815和ISO7975标准,进行了转向行驶和制动试验,验证了所建模型的正确性.