Akt在中华绒螯蟹免疫中的功能

Akt作为PI3K-AKT 信号通路的核心分子,在细胞增殖、代谢、发育和存活等过程中发挥重要作用。本研究采用特异性引物及PCR技术,克隆获得了中华绒螯蟹Akt基因 (EsAkt)并进行生物信息学分析,实时定量PCR技术检测了EsAkt在中华绒螯蟹不同组织和不同免疫刺激后的表达水平,免疫荧光技术检测了EsAkt蛋白的细胞定位,双链RNA干扰技术分析了EsAkt干扰后凋亡基因的变化。结果显示,EsAkt分子包含PH结构域、中心催化结构域 (S_TKc)和羧基端疏水结构域 (S_TK_X) 3个保守的结构域。EsAkt在所有被检测的组织中呈现组成型表达,且在免疫相关组织 (如肝胰腺、鳃和血淋巴细胞)中的表达量显着高于胃和肠道。EsAkt蛋白主要以弥散状的形式分布在细胞质中。中华绒螯蟹注射脂多糖 (LPS)和嗜水气单胞菌后,显著诱导EsAkt转录本的表达,LPS免疫刺激12 h后,EsAkt响应达到峰值,为对照组的4.35倍,刺激48 h后,EsAkt的mRNA表达水平有所降低,但仍是对照组2.62倍。嗜水气单胞菌免疫刺激6 h后,EsAkt响应达到峰值,为对照组的9.05倍,刺激48 h后,EsAkt的mRNA表达量回落到正常水平。双链RNA干扰EsAkt后,EsAkt的mRNA表达量为对照组的0.38倍,而凋亡相关基因EsCaspase-3-like表达水平显著上调,为对照组的2.69倍。研究表明,EsAkt基因在中华绒螯蟹免疫中发挥重要作用,参与了机体对细菌引起的免疫应激过程。本研究丰富了中华绒螯蟹PI3K-AKT信号通路研究的基本资料,为进一步研究甲壳动物免疫防御机制奠定了基础。     

卵形鲳鲹TLR13基因的克隆、表达分析和亚细胞定位研究

Toll样受体(Toll-like receptor, TLR)是一种古老的先天性免疫受体,参与病原体相关分子模式识别,对维持免疫稳态和预防感染至关重要。本研究克隆和鉴定了卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus) TLR13基因(命名为ToTLR13),其开放阅读框(ORF)为1 269 bp,编码422个氨基酸,等电点为8.13。保守结构域分析显示,ToTLR13含有跨膜结构域(TM)、LRR结构域和TIR结构域,符合TLR家族的典型特征。通过建立TLR13保守域三级结构发现,ToTLR13与小鼠(Mus musculus)和大黄鱼(Larimichthys crocea) TLR13功能结构域的蛋白三级结构具有较高重叠性。多序列比对显示,ToTLR13与其他硬骨鱼TLR13具有较高的相似性,与其他纲物种的序列相似性较低。系统进化树结果显示,ToTLR13与硬骨鱼TLR13聚在一起,其中与鞍带石斑鱼(Epinephelus lanceolatus)最为接近,与哺乳动物、两栖类和贝类相分离。实时荧光定量PCR (Real-time fluorescence quantitative PCR, RT-qPCR)分析显示,ToTLR13在健康卵形鲳鲹的心、鳃、肾、头肾、肝、脾、脑和肌肉中普遍表达,其中鳃的表达量最高,其次是脾。ToTLR13在其鳃、脾、肝和肾免疫相关组织中的表达情况呈现出不同程度的上调,提示其经无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)和溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)免疫刺激后可能激活了炎症反应,启动了先天性免疫反应。亚细胞定位显示,ToTLR13定位于A549细胞质。本研究表明,ToTLR13在抵御病原菌免疫应答过程中可能发挥重要的作用,研究结果可为阐明脊椎动物TLRs的功能进化史提供基础资料。     

龙眼胚性悬浮细胞原生质体培养及其体胚发生再生植株

以“红核子”、“东壁”、“十二月龙眼”等龙眼品种的胚性悬浮细胞为起始材料分离原生质体,采用液体浅层培养、包埋悬浮培养等方式,进行原生质体培养与植株再生研究。研究结果表明,海藻酸钙包埋悬浮振荡培养(50r/min)是龙眼悬浮细胞原生质体培养的适宜培养方式,在含有多种生长调节剂的改良MS培养基(MP6)上,再生小克隆的形成频率可高达5%;采用龙眼胚性愈伤组织体胚诱导、成熟和萌发的优化方案,原生质体再生小克隆分化子叶形胚状体的频率达100%,萌发植株的频率一般大于45%。      

水稻籽粒库强与其淀粉积累之间关系的研究

本试验以源限制型水稻品种亚优2号、献改优63和汕优63为材料，研究籽粒发育过程中籽粒库强与其淀粉积累之间的关系。结果表明：（1）强、弱势粒淀粉积累与其胚乳细胞的数目密切相关，两者表现出明显的同步性；（2）强势粒蔗糖合成酶、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶和淀粉合成酶最大活性高峰出现时间显著早于弱势粒的出现时间，     

低pH对葛藤根瘤菌生长的影响

为了研究低pH对葛藤(Pueraria lobata)根瘤菌PR390生长的影响,选取葛藤根瘤菌PR390作为研究对象,设置pH7.0、5.5、5.0、4.8、4.6、4.4六个梯度对根瘤菌生长的影响;研究结果表明：低pH对PR390菌体、菌落大小产生了明显抑制作用;在低pH的液体培养基中PR390表现为生长延滞期增长,对数生长期滞后,稳定期延迟,平均代时增长;在不同酸性土壤悬液中,土壤悬液酸性降低,根瘤菌数目随之减少。说明低pH对PR390生长产生了明显抑制作用,同时表明PR390具有较强的耐酸能力,能够抵制低pH对菌体产生的危害。     

干旱胁迫诱导苹果属植物细胞程序性死亡的研究

用聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG6000) 对苹果属植物平邑甜茶(Malus hupehensis pampReld. ) 和新疆野苹果〔M. sieversii (Ledeb) Roem. 〕幼苗进行水分胁迫处理, 通过Southern杂交和Western杂交的方法检测胁迫条件下幼苗体内DNA Ladder及Caspase23蛋白酶。Southern杂交结果表明, 干旱处理后, 两种苹果的根和叶片中都有DNA Ladder产生; Western杂交结果显示, 在苹果的叶片中有杂交印迹,而根中没有。这说明干旱胁迫可以诱导两种苹果属植物发生细胞程序性死亡, 并且在细胞程序性死亡过程中叶片中都有类Caspase-3蛋白酶的产生。     

高温对茶树叶片光合及抗逆特性的影响和恢复

以4个茶树品种福鼎大白茶、鸠坑、龙井43和乌牛早7a生植株为研究对象,采用人工气候箱模拟高温（35℃和40℃）处理6、12、18、24、48h,取出后置于人工气候箱中（25℃）恢复3、6、9d,以未经高温处理置于人工气候箱中（温度25℃）的各品种茶树为对照（CK）,测定茶树叶片的最大净光合速率、荧光参数、抗氧化酶活性以及细胞伤害率。结果表明：高温胁迫显著抑制了茶树的最大净光合速率（Pnmax）和最大光化学效率（Fv/Fm）,处理时间越长、温度越高,Pnmax和Fv/Fm下降越快,除35℃处理的福鼎大白茶外,其它3种茶树经过高温处理后,在恢复期间其Fv/Fm无法恢复至正常水平;茶树叶片的SOD酶活性在高温处理的前12h迅速上升,随着处理时间的延长,其活性降低;叶片MDA含量的平均值在高温处理第48小时达到最大,恢复期间缓慢下降;随着处理温度的升高和处理时间的延长,各茶树叶片的细胞伤害率均呈增加趋势。4种茶树耐热性的强弱由高到低依次为福鼎大白茶＞乌牛早＞鸠坑＞龙井43。     

牛磺鹅去氧胆酸对小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞凋亡的影响

为了探讨牛磺鹅去氧胆酸（TCDCA）对小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7的抗凋亡作用,试验采用二苯胺法及实时荧光定量PCR技术分别检测了针对RAW264.7细胞凋亡百分率及凋亡抑制蛋白CIAP-1、CIAP-2和XIAP的mRNA表达影响。结果显示,剂量为0.05、0.10和10 μg/mL TCDCA可以极显著地对抗地塞米松（DEX）诱导的RAW264.7细胞系凋亡（P < 0.01）。1 μg/mL TCDCA对正常RAW264.7细胞系CIAP-1和XIAP表达有显著的促进作用（P < 0.05）;10 μg/mL TCDCA对正常RAW264.7细胞系CIAP-1、CIAP-2和 XIAP表达均具有显著的促进作用（P < 0.05）。TCDCA给药后对DEX诱导的RAW264.7细胞系CIAP-1、CIAP-2和 XIAP表达均具有极显著的促进作用（P < 0.01）,但不同给药剂量的TCDCA作用有所差异。以上研究结果表明,TCDCA具有对抗DEX诱导的小鼠巨噬细胞系RAW264.7凋亡作用,且与上调凋亡抑制蛋白mRNA表达有关。     

Nsp9基因在Marc-145细胞上对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的影响

试验旨在验证Nsp9基因是否影响猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）的复制。构建含有Nsp9全长基因的质粒pIRES2-EGFP-Nsp9,并转染到Marc-145细胞中,接毒之后分别通过实时荧光定量PCR和Western blotting方法测定PRRSV N蛋白在mRNA和蛋白水平的表达。结果显示,转染Nsp9基因的Marc-145细胞上PRRSV的N蛋白在mRNA水平上显著高于未转染Nsp9基因的对照组（P<0.05）,是对照组的1.5倍,同时转染Nsp9基因后的Marc-145上PRRSV N蛋白水平也明显高于对照组。随着剂量的增加,N蛋白的表达量在mRNA和蛋白水平都有所增加。由以上结果初步可知,Nsp9基因可以在Marc-145细胞上促进PRRSV的复制,Nsp9基因与其复制密切相关。     

多浪绵羊骨骼肌卫星细胞的分离培养、鉴定及成肌诱导分化

为了在体外细胞水平模拟多浪绵羊肌肉生长发育过程,本研究以多浪绵羊为试验动物,采用胶原酶和胰酶两步酶消化法分离多浪绵羊骨骼肌卫星细胞（satellite cells,SCs）,并利用差速贴壁的方法纯化分离得到的SCs。利用免疫荧光技术检测SCs标记基因Desmin、Pax7和MyoD1的表达情况,鉴定分离得到的SCs。采用血清撤离的方法诱导SCs向成肌方向分化。通过显微镜观察和成肌分化标记基因肌球蛋白重链（myosin heavy chain,MHC）的免疫荧光,检测肌管的形成情况。通过对SCs标记基因Desmin、Pax7和MyoD1的免疫荧光鉴定,确认本研究成功分离得到多浪绵羊SCs。采用血清撤离的方法诱导SCs成肌分化,显微镜观察和MHC免疫荧光可以明显观察和检测到肌管的形成。本研究对多浪绵羊SCs成功地进行了分离和鉴定,并建立了体外培养条件下多浪绵羊SCs的成肌诱导分化。