棉蚜P450 CYP6CY3的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备

【目的】克隆得到棉蚜(Aphis gossypii)P450 CYP6CY3,将其开放阅读框(ORF)在原核细胞中进行表达,纯化融合蛋白,多次免疫小鼠获得CYP6CY3多克隆抗体,为进一步分析CYP6CY3在棉蚜不同组织部位的分布及其在抗性中的作用打下基础。【方法】利用RT-PCR及3′-RACE技术克隆获得CYP6CY3的ORF,并对其进行生物信息学及系统进化分析。构建重组质粒pET32a-CYP6CY3,转化大肠杆菌transetta(DE3)进行原核表达,利用切胶回收法获得纯化的融合蛋白,继而用纯化得到的融合蛋白免疫昆明白小鼠制备鼠抗棉蚜CYP6CY3多克隆抗体;ELISA检测鼠抗CYP6CY3蛋白多克隆抗体的效价,并通过Western blot及免疫组化检测该抗体特异性。【结果】棉蚜CYP6CY3 ORF长1 266 bp,编码421个氨基酸,预测蛋白分子量为48.8 k D,理论等电点为8.99,不含有信号肽序列,属亲水性蛋白;氨基酸序列包括W×××R、AG××T、E××R、P××F×PE/DRT和F××G×××C×G 5个P450家族的特征基序。通过NCBI Blastx进行同源序列的比对分析,棉蚜CYP6CY3氨基酸序列与豌豆长管蚜(Acyrthosiphon pisum)(XP_001948581.1)氨基酸一致性最高,达到81%,与麦双尾蚜(Diuraphis noxia)(XP_015379193.1)一致性为79%,与桃蚜(myzus persicae)(AHB52749.1)氨基酸序列一致性为76%,4种蚜虫的氨基酸序列都含有位于螺旋K中参与稳定核心结构的E××R完全保守序列及P450基因标志性的F××G×××C×G(358—367)血红素结合位点的共有序列。使用MEGA5软件构建系统进化树,显示棉蚜、豌豆长管蚜、麦双尾蚜及桃蚜聚为一类,亲缘关系较近。通过原核表达得到的CYP6CY3融合蛋白的相对分子量约为66 k D,基于纯化的CYP6CY3重组蛋白多次免疫昆明白小鼠制备多克隆抗体,ELISA检测获得的鼠抗CYP6CY3抗体效价达到1﹕409 600。Western blot和免疫组化进一步证实,该抗体既能与异源表达的CYP6CY3蛋白特异性结合,也能与棉蚜组织中存在的天然CYP6CY3蛋白特异性结合,具有较好的免疫反应特异性。【结论】利用3′-RACE技术克隆获得CYP6CY3的开放阅读框,并用异源表达的蛋白免疫昆明白小鼠制备了高滴度、特异性强的鼠抗棉蚜CYP6CY3的多克隆抗体,可用于进一步研究CYP6CY3功能及其在棉蚜抗药性方面的作用。     

聚β-羟基丁酸酯对中国明对虾抗WSSV能力的影响

为探索聚β-羟基丁酸酯(PHB)对感染白斑综合征病毒(WSSV)的水生动物存活率、病毒含量的影响,实验采用单因子浓度梯度法,对感染WSSV的中国明对虾投喂添加了不同浓度聚β-羟基丁酸酯(0.0%、0.5%、1.0%、2.5%、5.0%、10.0%)的饵料,统计相同时间点对虾死亡数量、存活率、相对免疫保护率(RPS),并利用real-time PCR测定死亡对虾体内病毒绝对含量。结果显示,PHB对中国明对虾存活率、平均存活时间及体内病毒拷贝数均有一定影响,主要表现在与对照组(0.0%)相比,随PHB浓度的升高,实验组对虾存活率和平均存活时间呈现先上升后下降趋势。各组平均存活时间为82.23、90.71、95.55、91.15、85.56及79.40 h,1.0%浓度组实验对虾平均存活时间与0.5%及2.5%浓度组无显著差异(P0.05),但是显著高于其余各组(P0.05);各组累计死亡率均为100%。另外还发现各组平均病毒拷贝数为1.08×107,1.15×107,4.75×107,1.27×107,1.14×107,3.29×106个/ng DNA;对照组与1%浓度组病毒含量具有显著差异(P0.05)。结果表明,PHB能提高中国明对虾抗WSSV的能力且1%PHB浓度为最适浓度。     

种植密度对棉株氮素库源分配的影响

[目的]探寻不同密度处理棉株的氮素库源分配情况,找出密度与库源分配合理的搭配以指导生产实践.[方法]设置5种(A1 ～A5)不同密度,采用随机区组设计,对棉株库源器官中氮素的分配比例及变化规律进行研究.[结果]种植密度对棉花氮素的吸收、利用影响较大,单株的氮素含量随密度的增大而减小,盛铃-见絮期积累速度大,各处理积累量均达到最高,9.0×104株/hm2处理最大,为430g/株,27.0×104株/hm2处理最小,仅为161g/株.在不同库源器官氮素分配中,根系作为氮素营养吸收器官,苗期浓度较高,随后基本维持在1;左右,且因滴灌模式,密度影响只在苗期和吐絮期才较明显的显现出随密度增加而减小;各处理叶源的氮素浓度最高且超过2.5;,其次为库器官蕾、铃,最后为茎源.[结论]中间密度处理氮素在源库分配中,相比其他处理铃库与叶源比例较高且相对协调,都达40;以上,更有利于干物质的供应与产量的形成.     

乳化剂对肉鸡肠道菌群及免疫功能的影响

本试验旨在研究日粮中添加乳化剂对爱拔益加(AA)肉鸡肠道菌群、免疫器官指数及血清免疫球蛋白的影响。将640只1日龄AA肉鸡随机分为4组,每组8个重复,每个重复20只鸡。试验1组为正对照组,饲喂正常油脂水平日粮;试验2组为负对照组,日粮中油脂添加量降低0.5%;试验3组为乳化剂1,在低于正常水平油脂日粮中添加0.05%乳化剂1;试验4组为乳化剂2,在低于正常水平油脂日粮中添0.05%乳化剂2。在试验42 d时,采集血样、免疫器官和肠道食糜用于检测试验指标。结果表明,乳化剂显著降低了盲肠内的产气荚膜梭菌数量(P<0.05),但对大肠杆菌数量无显著影响(P>0.05);乳化剂可以显著提高脾脏指数和法氏囊指数(P<0.05),但对胸腺指数无显著影响(P>0.05);乳化剂对血清免疫球蛋白A(IgA)和M(IgM)有显著的提高作用(P<0.05),但对免疫球蛋白G(IgG)无显著影响(P>0.05)。提示,在肉鸡低油脂日粮中添加乳化剂可以改善肉鸡肠道菌群,增强免疫能力。     

棉铃虫中肠谷胱甘肽S-转移酶(GST)对新疆一枝蒿黄酮提取物和萜类提取物的响应

[目的]研究新疆一枝蒿提取物黄酮及萜类提取物对棉铃虫解毒酶谷胱甘肽S-转移酶(GST)的影响,探明外源有毒物质对该解毒酶表达规律的影响,阐明棉铃虫与植物次生物质相互作用的机制,为发展新型无公害植物源农药提供理论依据.[方法]从新疆一枝蒿中分离提纯黄酮与萜类提取物,以室内饲养棉铃虫(3龄幼虫)为对象,利用生物测定、实时荧光定量PCR及酶联免疫吸附测定法,分别测定新疆一枝蒿中黄酮与萜类提取物对棉铃虫的毒杀效果及其在mRNA水平和蛋白水平上对GST表达的影响.[结果]黄酮和萜类提取物对棉铃虫3龄幼虫在24 h时的半致死浓度LC50分别是21.4和4.1 mg/100 g,在48 h时的半致死浓度LC50分别是19.3和3.1 mg/100 g;实时荧光定量PCR结果表明GST在mRNA水平的表达量受到诱导,时间效应为当黄酮和萜类提取物浓度分别为20和2 mg/100 g时,GST在12 h时能够被两种物质显著诱导表达,而在24 h时表达受到抑制;浓度效应为在18h时,黄酮和萜类提取物浓度分别为20和2 mg/100 g时显著诱导GST的表达,而在40和4 mg/100 g时抑制GST的表达;酶联免疫吸附测定结果表明,萜类和黄酮在时间和浓度效应上都能显著诱导GST蛋白表达,并且蛋白水平在时间与浓度效应中的表达趋势与mRNA水平相类似.[结论]GST对外源物质新疆一枝蒿的黄酮提取物和萜类提取物存在积极响应,低浓度或短时间内黄酮和萜类均能诱导GST的过表达,从而化解外源毒性,而浓度过高或时间过长则抑制其表达.     

生物炭对鸡粪好氧堆肥主要氮素形态含量影响与保氮机制

生物炭对鸡粪好氧堆肥过程氮素形态含量影响及保氮机制的研究对有害气体减排、氮素减损控制以及好氧堆肥工艺的深度优化具有重要意义。以鸡粪和麦秸为主要原料,通过添加适量生物炭,利用实验室智能型好氧堆肥反应器系统进行了好氧堆肥试验。基于获取的主要理化、生物学指标以及氮素存在形态动态数据,结合扫描电镜和主要种类微生物数量动态变化分析,研究了好氧堆肥过程主要氮素形态含量变化并初步阐释了生物炭保氮机制。研究结果表明:添加生物炭有利于鸡粪好氧堆肥过程氨气减排和减少氮素损失;堆肥过程氨气排放量与铵态氮浓度和硝态氮浓度分别呈显著正相关关系(r=0.783,p=0.0370.05)和高度显著负相关关系(r=-0.941,p=0.0170.05)。生物炭多孔结构能有效吸附铵态氮和氨气等氮素物质,降低堆体铵态氮浓度,进而减少氨气挥发;生物炭能为硝化细菌等微生物群落提供适宜的环境,有利于促进硝化反应并抑制氨气挥发。     

鸭梨几丁质PbChiIV的克隆与表达

【目的】从鸭梨果实中克隆PbChiIV的全长cDNA序列,检测PbChiIV在根、茎、叶、果实以及在水杨酸（SA）和梨轮纹病菌诱导下的表达特性,以探讨该基因与SA信号转导及抗梨轮纹病菌的相关性。【方法】设计特异引物,克隆PbChiIV的全长序列,将测序得到的核苷酸序列和推导的氨基酸序列在NCBI上用BLAST进行序列相似性分析,利用BiotEdit软件对氨基酸序列进行比对,利用MEGA6.0构建系统发育树,利用实时荧光定量PCR技术分析该基因在梨不同组织以及在SA和梨轮纹病菌诱导下的表达。【结果】克隆了PbChiIV的cDNA序列为819 bp,GenBank数据库登录号为KJ872676。生物信息学分析表明,PbChiIV编码272个氨基酸,与沙梨的同源性达100%,与毛果杨（XP_006376418.1）、葡萄（NP001268173.1）、拟南芥（CAA74930.1）、紫花苜蓿（ACL36992.1）、蒺藜苜蓿（AAR87869.1）、豇豆（CAA61281.1）、榛子（AEM97876.1）、东方山羊豆（AAP03085.1）、葡萄（NP_001268075.1）、华东葡萄（ABY66958.1）、葡萄（AAB65777.1）、烟草（BAF44533.1）和海岛棉（AER29902.1）的同源性分别为79%、73%、73%、72%、72% 、72%、69%、68%、67%、67%、65%、67%和62%,属于第IV类几丁质酶基因。表达分析表明,PbChiIV在根中的表达量最大,分别是茎和叶的4.32和2.96倍,其次是在果实中的表达量,分别是茎和叶的2.48和1.70倍,在叶片和茎中的表达相对较低。在鸭梨幼果和成熟期果实中,SA和梨轮纹病菌均可诱导该基因表达。SA处理后基因的最大表达量是对照的2.83和3.8倍,病原菌处理后基因的最大表达量是对照的1.82和1.66倍,SA、病原菌处理后基因的最大表达量是对照的2.49和3.43倍,表达量分别在72、24和72 h达到最大值。【结论】PbChiIV可能参与SA介导的植物抗病防卫反应的信号通路,推测其参与梨轮纹病菌引起的防卫反应,在鸭梨抗病过程中起作用。     

禁牧政策下农户违规放牧行为研究——以宁夏盐池县为例

禁牧政策在取得阶段性成果的同时,伴随的问题也越来越突出。农户作为禁牧政策的主体,其行为直接影响政策的可持续性。文中基于2011-2013年在宁夏盐池县的实地调研和问卷调查,揭示了禁牧政策下农户违规放牧行为特征、原因及影响因素。结果表明:农户违规行为具有博弈性、风险性的特征,其主要成因是追求个人利益最大化,受农户禀赋,包括资源、资金及能力的禀赋,草原的产权不清晰与政府管理执行力度差异的影响。建议政策制定的过程中,从农户角度出发,对草原进行合理管理与利用,而非一刀切的禁牧。     

玉米大斑病菌漆酶基因Stlac2结构分析及原核表达

【目的】对玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)漆酶基因Stlac2进行生物信息学分析,推测其蛋白功能,探究木质素降解过程中产生的小分子物质对Stlac2表达的影响,并对其进行克隆及原核表达,以便深入研究该基因在病菌生长、发育及致病过程中的作用。【方法】通过NCBI查询获得玉米大斑病菌EOA90070(Stlac2)基因的全序列,通过Clustal X与马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)PbrB(PMAA_082060)基因、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)Abr2(AFUA_2G17530)基因、构巢曲菌(Aspergillus nidulans)YA(AN6635)基因等漆酶家族基因进行蛋白序列比对,查看Stlac2中的铜离子结合位点,利用在线软件SOPMA和ProtParam对其二级结构及理化性质进行检测,通过SWISS-MODEL对Stlac2蛋白质的三维结构进行预测,采用SAVES对三维结构进行评价。通过对ABTS的氧化试验确定木质素降解过程中产生的小分子物质对玉米大斑病菌漆酶产量的影响;利用RT-qPCR方法分析小分子物质对Stlac2表达规律的影响;采用原核表达系统,以pET-30a表达载体为框架,对其进行原核表达,并将表达蛋白纯化,以ABTS为底物,420 nm下检测漆酶活性。【结果】Stlac2具有典型的Cu离子结合位点,与漆酶典型的Cu离子结构域相似。其蛋白二级结构中α-螺旋、延伸链、β-转角、无规则卷曲所占比例分别为18.59%、25.63%、11.91%和43.86%,分子量为61.64 k D,等电点为5.00,平均疏水性为-0.37,表明其为亲水蛋白。当在PDA中添加0.01 g·L~(-1)香草醛、4-羟基苯甲醛、丁香醛、香草酸、4-羟基苯甲酸和香兰素时,玉米大斑病菌胞外漆酶的产量为香草酸香兰素4-羟基苯甲醛4-羟基苯甲酸丁香醛对照。而在4-羟基苯甲醛和4-羟基苯甲酸存在时,玉米大斑病菌Stlac2的相对表达量明显升高,约为对照的5—8倍。利用原核表达系统,在67 k D处成功诱导表达出一条特异性蛋白条带,大量表达纯化后,漆酶活性为(40.7±0.3)U·L~(-1)。【结论】阐明了Stlac2的生物信息学特性,初步断定其为漆酶基因;4-羟基苯甲醛和4-羟基苯甲酸可显著提高Stlac2相对表达量,表明其在木质素降解过程中起到了一定的作用;该基因所编码的蛋白可通过pET-30a原核表达系统表达,体外漆酶活性可达(40.7±0.3)U·L~(-1),该研究结果为后期研究蛋白性质打下了基础。     

不同自然光环境下土庄绣线菊的生理生态响应

以管涔山常见野生灌木土庄绣线菊Spiraea pubescens为材料,选择10%~20%、30%~40%、50%~60%和100%4种相对光强水平,研究了不同森林光环境下生长的土庄绣线菊成年植株的光合特性、光合色素含量、比叶面积、高茎比和生物量分配特征,调查了土庄绣线菊在生理生态特征上的光适应性和表型可塑性,为森林生态系统的维护和恢复提供依据。结果表明:深度遮荫(10%~20%)相对于全光照下土庄绣线菊成年植株最大净光合速率、叶绿素a/b降低,胞间/大气CO2浓度比、叶绿素a含量、类胡萝卜素/叶绿素总量、比叶面积升高。高径比、根生物量比、茎生物量比和地上地下生物量比的极值出现在中度(50%~60%)或轻度(30%~40%)遮荫下。随着遮荫的加剧,蒸腾速率、叶生物量比未发生变化。土庄绣线菊生理可塑性和生物量分配可塑性均较低。土庄绣线菊对不同光环境的生理生态响应说明它是耐阴兼性喜光的,对光环境的适应性强,这与土庄绣线菊分布广泛的特点相一致。