TLR4信号分子在脂多糖诱导小鼠肝损伤过程中的变化

为了阐明LPS诱导小鼠肝损伤过程中TLR4信号分子的变化,本试验以昆明小鼠为研究对象,经腹腔注射LPS,从形态学和肝功能指标变化判定肝损伤模型的建立,利用RT-PCR法检测各组肝脏组织中TLR4、IL-10、TNFα的转录水平。结果表明,随着LPS作用时间的延长,肝脏组织病理变化明显,肝窦不同程度充血,炎性细胞浸润,肝细胞呈现点状、小片状或多灶性坏死;血液和肝脏中GPT和GOT的活性升高,升高幅度依赖LPS作用时间,提示成功建立了肝损伤模型;RT-PCR结果显示,LPS诱导肝组织TLR4、IL-10、TNFα表达增加,且具有时间依赖性,TLR4、IL-10在3h表达开始升高,12h达高峰,TNFα变化幅度不如TLR4、IL-10变化显著,提示TLR4、IL-10、TNFα的表达水平依赖于肝损伤程度。     

产低毒性脂多糖大肠杆菌J5基因重组株的构建

细菌脂多糖(LPS)对宿主细胞具有一定的毒性,但经修饰后的单磷酸类脂A(MPLA)却是一种无毒性的高效免疫佐剂。选择天然O抗原不完全的大肠杆菌J5疫苗株为出发菌株,利用λ-Red同源重组技术导入外源弗朗西斯菌(Francisella novicida)lpxE基因,缺失大肠杆菌lpxM基因。结果显示,J5ΔlacI::lpxEΔlpxM基因重组株的LPS鲎试剂活性较DH5α和J5原菌显著降低;对4周龄的ICR小鼠腹腔注射LPS提取物,重组菌和PBS组的小鼠体征及肝脏切片均正常。同时,腹腔注射大肠杆菌J5和DH5α的小鼠被毛凌乱、精神抑郁、肝脏细胞肿大,发生炎性浸润,有明显的毒性反应。以上结果说明,J5重组菌的LPS已经区别于原菌,是低毒性的MPLA产物。上述重组株的成功构建,能为生产廉价的兽用MPLA免疫佐剂奠定工作基础。     

白藜芦醇对脂多糖诱导草鱼肾脏细胞炎症的抑制作用

为评价白藜芦醇(resveratrol)对脂多糖诱导损伤草鱼(Ctenopharyngodon idella)肾脏细胞(CIK)的保护作用,本研究通过脂多糖(LPS)诱导细胞炎症损伤,测定和分析白藜芦醇对CIK细胞抗氧化因子活性和抗氧化、炎症相关基因表达变化的影响。结果表明,与对照组相比,LPS处理导致CIK细胞活力降低(P<0.05),乳酸脱氢酶(LDH)活性升高(P<0.05),降低了细胞内过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性,并导致还原型谷胱甘肽(GSH)浓度降低(P<0.05)和丙二醛(MDA)含量升高(P<0.05)。此外,LPS处理能引起CIK细胞的CAT、TNF-α、IFN-γ、IL-1基因表达显著上调(P<0.05),而对IL-10和SOD基因的转录表达无显著影响(P>0.05)。通过向培养基中添加白藜芦醇(4μg/mL)可以显著减弱LPS对CIK细胞造成的损伤,维系细胞抗氧化能力,抑制TNF-α等炎症相关基因的表达(P<0.05),促进CAT基因的表达(P<0.05)。研究认为白藜芦醇对LPS造成的CIK细胞损伤有明显的干预作用,主要原因可能是由于白藜芦醇对CIK细胞的抗氧化能力的改善以及对促炎因子表达的抑制。本研究可为白藜芦醇应用于鱼类炎症、氧化损伤相关疾病的防治提供理论依据。     

牛布氏杆菌病热酚法脂多糖抗原酶联免疫吸附试验(ELISA)的研究

采用世界动物卫生组织(OIE)推荐的热酚法提取的脂多糖(LPS)作为抗原，建立了牛布氏杆菌病的ELISA方法，对45份血清进行检测，证明本ELISA方法灵敏性较高，经阻断试验和交叉试验，证明特异性较好。同时对建立的ELISA方法进行了改进，使制备的牛布氏杆菌ELISA试验试剂盒能在4℃条件下长期保存，具有良好的稳定性和重复性。     

细菌类脂多糖(Lps)对桑蚕血球细胞培养系的蛋白激酶C和A活性的诱导

使用含桑蚕血球细胞(主要是颗粒细胞和浆细胞)的离体培养系,经各种刺激物诱导后,对蛋白激酶C(下称PKC)和蛋白激酶A(PKA,需cAMP型)的活性进行了试验。血球细胞经大肠杆菌中的类脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、离子霉素、霍乱弧菌产生的霍乱毒素或笨基乙酸汞(杀菌剂)(4β—phorbor 12—myristate 13 acetate)(PMA)处理后便可清楚地检测到PKC的活性,而没有上述刺激物诱导时,其活性情况没试验过。结果表明,不仅LPS而且Ca~(2+)和一种G蛋白均可能参与了PKC活性诱导的信号转导。同样用LPS、dcAMP、离子霉素或霍乱毒素处理血球细胞,对PKA的活性进行了类似的检测,而不经处理的对照细胞没有PKA活性,而且LPS、cAMP、Ca~(2+)和G蛋白很可能也参与了PKA活性诱导过程中的信号转导。用抗兔脑PKC—α的单克隆抗体进行蛋白质印迹分析,结果以LPS处理的血球细胞样品中有一种与单抗有交叉反应的90KDa蛋白质,而未经LPS处理的对照样品不存在这种蛋白。桑蚕血球细胞内的PKC和PKA被细菌感染后的LPS激活后,可以诱导自身防御反应,例如抗菌蛋白基因的表达。     

复合免疫应激对肉鸡免疫功能和肝脏脂代谢的影响及其调控

旨在评估免疫应激状态下AA肉鸡新城疫疫苗免疫效果,观察其对免疫功能和肝脏脂代谢的影响以及抗应激剂的调控效果。选取160只AA肉仔鸡随机分为A、B、C、D、E等5个组,每组32只。A组为对照组,B、C组为250μg/kg细菌脂多糖(LPS)处理组,D、E组为500μg/kg LPS处理组;其中,在C、E组饲料中添加1%的抗应激剂。于12日龄起每隔3 d连续腹腔注射LPS共4次,于15,28 d各组分别接种鸡新城疫(ND)Ⅳ系苗,并于22,29,36,42 d将肉鸡称重、宰杀,检测抗体水平、免疫器官指数、肝脏胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)含量及其脂代谢相关基因mRNA表达。结果显示,与A组相比,D组能够显著增加法氏囊、胸腺和脾脏等免疫器官指数(P0.05),显著提高22 d ND疫苗抗体水平(P0.05)以及29 d肝脏TG含量(P0.05);B组能够显著增加脾脏指数(P0.05),显著提高22 d肝脏TC含量(P0.05)和29,42 d TG含量(P0.05);而2组免疫应激组均能显著上调22 d(P0.05)、下调22～42 d HMGR mRNA的表达量(P0.05),上调29,42 d ACC mRNA的表达量(P0.05),下调CPT-1和PPAR-αmRNA的表达量(P0.05)。添加1%的抗应激剂,与空白组相比,脾脏指数显著提高(P0.05);与免疫应激组相比,除了能显著提高36 d的脾脏指数外,法氏囊、胸腺指数差异不显著(P0.05),能够显著提高抗体水平(P0.05),降低42 d肝脏TC的含量(P0.05)和29,42 d TG的含量(P0.05),下调ACC mRNA表达量(P0.05)和42 d HMGR mRNA表达量(P0.05),上调CPT-1和PPAR-αmRNA表达量(P0.05)。结果表明,适度的免疫应激能够提高免疫器官指数和新城疫疫苗抗体水平;免疫应激有增加肝脏TC和TG的含量和脂肪肝的风险,其机理可能是通过调控HMGR、ACC、CPT-1和PPAR-αmRNA的表达量,促进胆固醇和脂肪酸的生成,抑制脂肪酸的分解;日粮中添加1%的抗应激剂能增强肉鸡体液免疫,改善肝脏脂代谢。     

甘氨酸对脂多糖刺激仔猪肝脏能量代谢及相关基因表达的调控作用

本试验旨在研究甘氨酸(Gly)对脂多糖(LPS)刺激断奶仔猪肝脏能量代谢、能量代谢关键酶和相关调节因子mRNA表达的调控作用。选取24头杜×长×大仔猪,分成4个组,每组6个重复。4个组分别为:1)对照组(基础饲粮);2)LPS组(LPS+基础饲粮);3)1.0%Gly组(LPS+基础饲粮+1.0%Gly);4)2.0%Gly组(LPS+基础饲粮+2.0%Gly)。试验第28天,试验组仔猪腹膜注射100μg/kg BW的LPS,对照组注射等量的生理盐水。试验猪于注射LPS或生理盐水4 h后屠宰,取肝脏样品待测。结果表明:1)与LPS组相比,1.0%Gly显著提高了仔猪肝脏三磷酸腺苷(ATP)浓度和能荷(EC)水平(P0.05),显著降低了一磷酸腺苷(AMP)/ATP值(P0.05),并有降低AMP浓度的趋势(P0.10);2.0%Gly有降低AMP/ATP值的趋势(P0.10)。2)与LPS组相比,1.0%Gly显著降低了仔猪肝脏己糖激酶2(Hexok2)和柠檬酸合成酶(CS)的mRNA表达量(P0.05);2.0%Gly显著降低了肝脏Hexok2和丙酮酸激酶(PK)的mRNA表达量(P0.05),并有降低肝脏CS mRNA表达量的趋势(P0.10)。3)与LPS组相比,1.0%Gly显著提高了仔猪肝脏腺甘酸活化蛋白激酶α1(AMPKα1)的mRNA表达量(P0.05)。综上所述,饲粮中添加Gly能够改善LPS刺激引起的断奶仔猪肝脏能量代谢紊乱,调控糖酵解和三羧酸循环等代谢途径中相关酶的表达。     

乳头灌注脂多糖对奶牛乳腺组织及机体免疫的影响

旨在通过乳头灌注脂多糖(LPS)体外模拟奶牛急性乳腺炎,研究奶牛乳腺组织及机体免疫活化状态。选用4头泌乳后期的荷斯坦奶牛16个乳区为研究对象,采用交叉试验设计,每期试验2 d,试验间隔10 d,试验组乳头管乳头灌注LPS 0. 1 mg,对照组乳头管灌注等量生理盐水。结果:试验组灌注LPS后,奶牛体温值和乳汁中体细胞数随时间变化而逐渐升高,而奶牛血液中白细胞数随时间变化而逐渐降低;乳腺组织的腺泡腔内充斥大量炎性细胞,部分腺泡组织萎缩甚至崩塌;试验组灌注LPS 12 h后奶牛血清中的髓过氧化物(MPO)活性极显著下降(P<0. 01),而乳腺组织中的MPO活性则极显著上升(P<0. 01);奶牛血清及乳清中炎症因子肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)的蛋白含量明显上升(P<0. 01);乳腺组织中Toll样受体4 (TLR4)、核因子NF-κB (p65)蛋白的表达量相比对照组极显著上升(P<0. 01)。研究表明,LPS能够诱导奶牛发生乳腺炎,使乳腺组织发生损伤,并激活机体的TLR4/NF-κB信号通路进而促进其下游炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的基因的表达,使机体发生免疫应答。