一种有效的沙棘总RNA提取方法

高质量RNA的提取是分子生物学和基因工程研究的必要前提.以盐胁迫过的沙棘叶片为实验材料,建立了一种有效的沙棘总RNA提取方法.该方法提取的沙棘总RNA得率较高,平均为213.94 μg/g(鲜叶),RNA的完整性好,纯度较好,利用丙酮和KAc有效的消除了多糖、多酚和黄酮的干扰.反转录实验证明,所提取的沙棘总RNA具有较强的反转录活性,能够运用到后续的分子生物学研究中.研钵等实验用品采用酒精燃烧的方式去除外源RNase,并且药品都是常规试剂,大大的节省了实验时间和降低了实验成本.     

药用植物白术ISSR-PCR反应体系的正交优化研究

采用正交试验设计的方法,对白术ISSR-PCR反应体系进行优化,确立了适合于白术的ISSR-PCR反应的最佳体系,即在25 μL反应体系中,10×buffer 2.5 μL,Mg2+3 mmol/L,Taq酶0.75U,模板200 ng,dNTP 0.3 mmol/L,引物0.5 μmol/L,通过梯度PCR试验得到相应引物的最佳退火温度为55.0℃.     

沙棘耐盐基因HrNHX1的克隆及3'UTR序列分析

以沙棘(Hippophae rhamnoides L.)叶片为材料,用改良SDS法提取总RNA,反转录合成第一链cDNA作为模板,根据已公布NHX1家族同源序列保守区设计简并引物,扩增出沙棘中HrNHX1基因的中间序列,然后用快速扩增cDNA末端(rapid amplification on of cDNA end,RACE)方法,从沙棘中克隆到HrNHX13'cDNA序列.该序列(GenBank登录号:EU718492)长度为1 373 bp,与已知NHXI序列同源性最大为80;,其编码区1 094 bp,编码364个氨基酸,3'非翻译区(3'-untranslated resion,3'trm)长度为239 bp.3'UTR序列分析显示沙棘的3'UTR与陆地棉、葡萄柚和小盐芥的同源性分别为43.97;、45.63;和40.64;,明显低于编码区的同源性.结果表明,NHX1基因编码区具有较高的保守性,3'UTR序列的同源性较低,显示了非编码区在环境适应中的重要性,并为进一步研究沙棘对生境的适应分子机制奠定了基础.     

阿月浑子性别鉴定的RAPD分析

应用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术对新疆阿月浑子(PistaciaveraL.)地方品种雌、雄株进行性别鉴定的研究。通过叶片总DNA抽提、RAPD标记分析及反复的试验筛选,找到了一个适用于新疆阿月浑子的RAPD反应体系和循环参数。采用OPO08引物对雌、雄株基因组DNA扩增出性别之间差异性的核苷酸片段,证实雄性植株DNA的扩增产物有一条大约700bp的特异性条带,而雌性植株则无此特异性条带。即找到一条与阿月浑子性别相关的基因标记,表明RAPD技术可应用于新疆阿月浑子地方品种的性别鉴定。此研究是对我国雌雄异株果树阿月浑子在分子水平进行早期性别鉴定的一个尝试。     

应用AML基因进行牛性别鉴定的研究

本文以染色体牙釉蛋白基因(AML)对牛肌肉基因组进行性别鉴定，为应用此基因进行胚胎鉴定提供理论依据。本研究应用奶牛染色体牙釉蛋白基因的DNA序列，设计了牛染色体特异性引物P1和P2，并通过聚合酶链反应(PCR)扩增牛肌肉组织中的X和Y染色体上的牙釉蛋白基因内第五内含子。最后依据其分子量的差异对电泳后的性染色体所呈现的不同区带进行区分，从而达到性别鉴定的目的，具有很高的应用价值。     

L-丝氨酸产生菌c-11中serA基因的克隆与表达

利用PCR技术以L-丝氨酸产生菌株黄色短杆菌c-11的染色体DNA为摸板,扩增出serA基因,连接到表达载体pEC7上,转化L-丝氨酸产生菌c-11,使其氨基酸产量由12 g/L增加到18 g/L,产酸率增加了50;.     

基于GR79 EPSPS筛选标记的抗虫抗除草剂表达载体构建及抗性鉴定

虫害和草害是农业生产中两大主要危害。目前,尽管转基因抗虫和抗除草剂作物相继报道和应用,然而我国抗虫抗除草剂复合性状作物培育仍然明显滞后,而且多依靠传统杂交选育的手段,费事费力、周期长。根据苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis, Bt）Cry1Ac蛋白结合结构域和毒性结构域特征,人工合成杀虫基因cry1Ac-2.5。同时,利用抗除草剂基因GR79 EPSPS替换卡那霉素筛选标记,构建基于草甘膦除草剂筛选标记的复合抗虫抗除草剂植物表达载体,并转化烟草。qRT-PCR结果表明转基因烟草cry1Ac-2.5和GR79 EPSPS基因转录水平均成功表达,经Bt和GR79试纸条检测表明上述基因在蛋白水平正确翻译。抗性实验表明,转基因烟草愈伤经草甘膦筛选,阳性率达到80%,且转基因烟草耐受100 mg/L草甘膦处理。抗虫实验表明,饲喂cry1Ac-2.5转基因烟草4 d后,棉铃虫幼虫死亡率为90%左右,表明人工基因cry1Ac-2.5具有显著的的抗虫效果。以上结果表明,构建的抗虫抗除草剂植物表达载体（Cry1Ac-2.5+GR79 EPSPS）将抗虫基因和抗除草剂基因有效合并,对于快速培育抗虫抗除草剂作物具有指导意义。     

奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌毒力因子检测与基因分型

用PCR方法对新疆乌鲁木齐周边3个奶牛场奶牛乳汁中分离到的49株金黄色葡萄球菌的entA、tsst-1、nuc、clfA、fnbA、fnbB、hla、hlb 8种毒力基因进行分子流行病学调查,并用肠道细菌基因间重复序列-PCR(ERIC-PCR)法对这49株金黄色葡萄球菌进行基因分型.结果: tsst-1、nuc、clfA、fnbA、fnbB、hla、hlb、entA毒力基因的检出率分别为4%、59.2%、63.3%、69.4%、22.5%、46.9%、53.1%、0,且以clfA、fnbA为主要检出毒力基因.ERIC-PCR分型结果显示:49株金黄色葡萄球菌可扩增出3～7条带,共分为4个聚类群,在同一牛场中的分离株存在不同基因型;而不同牛场中的分离株也可属于同一基因型.这种结果提示,在不同环境下同一种病原菌的基因型存在一定差异,可能存在多个金黄色葡萄球菌的流行株.     

新疆盐生植物猪毛菜逆向运输蛋白基因SaNHX1 3’-RACE的克隆及序列分析

以新疆盐生植物猪毛菜(Salsola collina Pall.)为材料提取总RNA,根据NHX1家族同源序列保守区设计1对简并引物,进行RT-PCR扩增,得到猪毛菜逆向运输蛋白基因cDNA中间一段619 bp序列。再用快速扩增cDNA 3’末端(3’RACE)方法,得到约1 000 bp 3’末端序列。将两段序列进行拼接,得到猪毛菜长为1 585bp(Gen Bank登陆号为EU072932)的逆向运输蛋白基因(SaNHX1)cDNA序列,编码370个氨基酸,其编码序列、氨基酸序列与同科耐盐植物盐角草相应序列同源性为85%和87%,研究为进一步克隆猪毛菜NHX1全基因序列和研究其功能打下基础。     

棉花线粒体基因组细菌人工染色体文库的构建

以P30A细胞质雄性不育系黄化苗为材料,采用蔗糖密度差速离心和不连续蔗糖密度梯度超速离心提取棉花线粒体,低熔点琼脂糖包埋和原位消化裂解的方法制备高分子量的线粒体DNA(mtDNA),经BamHⅠ,HindⅢ酶切和PCR扩增进行纯度鉴定,并对其进行部分酶切,酶切片段与载体连接,电击转入大肠杆菌DH10B中,成功的构建了棉花线粒体基因组BAC文库。该文库共挑取3 840个单克隆,平均插入片段大小为15.5 kb,覆盖率超过70倍,研究结果表明该基因文库具有较高的质量。