半滑舌鳎vasa调控区的克隆、表达载体构建及其驱动活性检测

为研究半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)vasa(Csvasa)基因调控区的功能,在已克隆的Csvasa基因编码序列的基础上,采用基因组步移和PCR扩增的方法克隆得到Csvasa调控区,通过生物信息学方法分析vasa基因5′区,并构建了含Csvasa基因调控区的绿色荧光蛋白(GFP)表达载体(p Csvasa-GFP-T),进一步通过显微注射技术初步验证调控区的驱动活性。结果表明,通过基因组步移和PCR扩增获得Csvasa 5′区5 166 bp和3′区1 655 bp,利用在线生物信息学软件对5′区序列进行分析,发现在转录起始点上游26 bp处存在保守的TATA框,以及潜在的转录因子结合点如SRY、Oct-1、Sox-5、CREB、GATA、AP-1、C/EBP、Sp-1、c-Myc、HNF、NKX2-5、V-Myb等。通过显微注射技术,将所构建的p Csvasa-GFP-T表达载体注射于青鳉(Oryzias latipes)受精卵并进行培养观测,发现Csvasa调控区能够驱动GFP在青鳉胚胎内表达,荧光表达率为81%。将有荧光的胚胎培养为成鱼,检测外源基因的整合率为11.5%。这些结果为进一步研究半滑舌鳎原始生殖细胞(PGCs)的标记、追踪和操作研究以及半滑舌鳎的性别控制等奠定了基础。     

镜鲤△6脂肪酸脱氢酶CDNA的克隆与表达

利用RT-PCR和RACE方法克隆得到镜鲤Cyprinus carpio肝脏中高不饱和脂肪酸(HUFA)合成代谢的脂肪酸去饱和酶(△6FAD)基因c DNA全序列。结果表明:镜鲤△6FAD基因c DNA全长为1 446bp,开放阅读框(ORF)为1 332bp,编码444个氨基酸。编码的蛋白序列包含FAD全部特征结构区,包括1个细胞色素b5结构域、2个跨膜区和3个组氨酸簇,与其他鱼类的Δ6FAD氨基酸序列具有69.0%~92.0%的同源性。系统树分析显示:与斑马鱼Danio rerio的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR(RT-q PCR)检测发现:脂肪酸延长酶基因在镜鲤肝脏中表达量最高,背部肌次之,在血液中表达最低。本研究结果为进一步研究镜鲤HUFA的合成途径及调控机理提供了基础资料。     

偏顶蛤胚胎和幼虫发育及温度对其浮游幼虫生长和发育的影响

在室内条件下,人工诱导偏顶蛤(Modiolus modiolus)产卵并在显微镜下对其胚胎和浮游期幼虫的形态进行连续观察和拍照,并采用实验生态学的方法,研究温度对其浮游期幼虫生长和发育的影响。结果显示,偏顶蛤亲贝人工催产时,以流水刺激4 h,阴干12 h为宜。偏顶蛤卵呈圆形或卵圆形,沉性卵,卵径为(82.6±3.2)μm,精子鞭毛型,全长约50μm。在水温19~21℃下,偏顶蛤受精卵发育至D形幼虫(壳长104.0μm±4.3μm)、匍匐幼虫(壳长255.8μm±15.0μm)和早期稚贝(壳长329.1μm±5.8μm)分别历时20.5 h、20 d和36 d。水温是影响偏顶蛤幼虫生长和发育的主要因素之一,幼虫适宜水温为15~20℃,15℃组幼虫畸形率显著低于20℃组,生长率20℃组最高达5.4μm/d;水温25℃和30℃下,幼虫畸形率均显著高于15℃组和20℃组,并分别在第6天和第4天全部死亡。相对于高温而言,偏顶蛤幼虫对低温的耐受能力更强。本文旨在为偏顶蛤繁殖生物学和苗种繁育技术提供基础资料。     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis) miR-223的表达特征及免疫应答分析

microRNA(miRNA)是一类内源性、长度约为22个核苷酸的非编码小单链RNA分子,由具有发夹结构的70-90个碱基的单链RNA前体经过Dicer酶加工而成.本研究使用荧光实时定量PCR (Quantitative Real-Time PCR, qRT-PCR)方法,研究了miRNA-223(miR-223)在半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)各健康组织、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染后各时间点的免疫组织以及不同病原类似物刺激后头肾细胞中的表达模式.结果显示,miR-223在半滑舌鳎各组织中均有表达,在头肾中表达量最高,在脑和血液中的表达量极低.鳗弧菌感染3组样品4种免疫组织,miR-223表达变化显著,感染后20 h内,鳗弧菌诱导miR-223上调表达.鳗弧菌感染后半滑舌鳎免疫组织miR-223表达变化规律显示,鳗弧菌感染2、6、12、24、48、72、96和168 h后,miR-223在肝、肠、脾、头肾4种组织中出现差异表达.其中,miR-223在半滑舌鳎肝、脾、头肾中表达上调,在肠中表达下调.用LPS、poly I:C、PGN、RGNNV感染半滑舌鳎头肾细胞后,发现经LPS、RGNNV诱导后miR-223上调表达,poly I:C、PGN诱导后miR-223下调表达.研究结果表明,miR-223参与了半滑舌鳎免疫应答过程.本研究结果有助于了解miRNA在半滑舌鳎对病原刺激免疫应答过程中的作用以及半滑舌鳎与病原相互作用中miRNA参与调控的机制.     

亚心形扁藻超滤浓缩技术研究

为了研究在亚心形扁藻(Platymonas subcordiformis)进行浓缩时,不同操作压力对单胞藻饵料浓缩机滤水率、藻细胞浓缩密度和藻细胞活性的影响,采用超滤技术,在操作压力分别为0.02、0.06、0.10、0.16、0.20 MPa的条件下,利用单胞藻饵料浓缩机对亚心形扁藻进行浓缩,并对不同浓缩时间的浓缩藻进行再培养。结果表明,随着压力的增加,浓缩机滤水率和藻细胞浓缩密度逐渐增大,压力为0.20 MPa时,浓缩机的滤水率最大、浓缩密度最大,浓缩8 h后,藻细胞密度最大,为(4.98±0.14)×10⁶ cells/mL;浓缩后藻细胞繁殖速度较快,超滤对藻细胞活性影响较小。     

半滑舌鳎StAR基因克隆及其在不同组织的时空表达分析

利用半滑舌鳎性腺转录组测序获得的StAR基因部分序列,设计RACE引物,克隆了半滑舌鳎StAR基因的cDNA序列,全长为1 294 bp,5'端UTR为132 bp,3'端UTR为310 bp,开放阅读框(ORF)为852 bp,共编码283个氨基酸。将半滑舌鳎StAR基因与其他物种StAR基因进行氨基酸同源性分析,结果显示,半滑舌鳎StAR与塞内加尔鳎、大口黑鲈、花鲈、金头鲷的同源性都达到了85%,与虹鳟、斜带石斑鱼及日本鳗鲡的同源性分别为81%、83%和76%。雌、雄鱼不同组织StAR基因的表达分析表明,StAR基因在雄鱼性腺中高表达,在雄鱼的肝脏、脑及心脏中表达量较低,而在雄鱼的其他组织中不表达;在雌鱼肠中不表达,在其他组织(卵巢、肝脏、脾脏、脑、垂体、肌肉、心脏、肾脏)中微量表达。荧光定量PCR分析不同组织与不同时期性腺表达谱表明,雄鱼性腺中StAR基因的表达量显著高于雌、雄鱼其他各组织(P0.05),提示StAR基因对雄鱼精巢发育起重要作用。雄鱼不同时期表达谱分析结果显示,StAR基因在66天前的精巢中不表达,在150天时表达量急剧增加,至2龄时表达量最高,3龄时表达量下降,说明该基因在精巢发育成熟过程中起重要作用。原位杂交结果显示,StAR基因主要在雄鱼精巢的精子细胞中表达,而在雌鱼的卵巢中不表达。研究表明,StAR基因在半滑舌鳎精巢发育中发挥作用,且可能在精子形成中发挥重要作用。     

循环水养殖系统生物滤器负荷挂膜技术

循环水养殖系统启动运行前往往需要经过一段时间的生物膜预培养,使生物膜达到成熟稳定,从而保证系统的水质净化功能。本研究通过养殖试验,研究了生物滤器负荷挂膜的技术方法,以期实现生物膜的快速成熟和系统的快速启动。为此,构建了6组循环水系统组成的养殖车间,建成后立即投入试验生产。试验为期120 d,养殖种类为红鳍东方鲀,初始放养平均体重(632.5±2.26)g。期间,红鳍东方鲀平均增重29.91%,养殖成活率98.7%,养殖密度由(19.34±1.89)kg/m3增加到(32.17±3.40)kg/m3,投饵率由0.2%增加到0.5%–0.7%,每日换水量由50%逐渐减至10%。结果表明,在生物膜的生长期,通过对投饵量及新水补充量的有效调节,可以把养殖水体中的氨氮和亚硝氮浓度控制在安全范围以内,以保证养殖鱼类的生长。生物膜在50天左右达到完全成熟,此后便可依靠生物膜的净化作用将氨氮浓度控制在0.5?1.2 mg/L、亚硝氮浓度控制在0.2?0.5 mg/L、pH值控制在6.5–7.5、COD值低于4 mg/L、细菌总数控制在800–2100 cell/ml的安全范围内。利用生物滤器负荷挂膜技术,在合理调控水质指标的条件下,循环水养殖系统建成后可以立即投入生产,实现生物滤器挂膜与养殖生产的同步进行。     

鲈鱼(Lateolabrax japonicus)生长后期对苏氨酸需要量

在半精制饲料中分别添加0、0.35%、0.70%、1.05%、1.40%、1.75%苏氨酸,制成苏氨酸实际梯度为1.05%、1.35%、1.65%、2.00%、2.42%、2.65%的6组等能等氮饲料(44.67%粗蛋白质,21.65 k J/g总能),对初始体重为(333.93±6.60)g的鲈鱼(Lateolabrax japonicus)在海水浮式网箱(1.5 m×1.5 m×2.0 m)中进行了70 d的喂养实验,研究其对苏氨酸的最适需求量。结果显示,鲈鱼成活率在89.58%–95.83%之间,各处理组之间无显著差异(P0.05);随着饲料中苏氨酸水平的升高,鲈鱼的特定生长率(SGR)显著增加(P0.05),且在2.00%苏氨酸饲料组出现最大值,但随着苏氨酸水平的继续升高,SGR呈减小的趋势;饲料效率(FE)随饲料中苏氨酸水平的升高呈先增加后减小的趋势,2.00%苏氨酸组的FE显著高于1.05%组及2.65%组(P0.05);随着饲料中苏氨酸水平的升高,蛋白质沉积率(PPV)呈先增加后减小的趋势,且于2.00%苏氨酸组出现最大值;肝脏谷草转氨酶、谷丙转氨酶活性随饲料中苏氨酸水平的升高呈先增加后减小的趋势;饲料中不同水平苏氨酸对鱼体粗蛋白、粗脂肪、粗灰分无显著影响(P0.05)。以特定生长率、饲料效率及蛋白质沉积率为评价指标,经二次回归分析得出,鲈鱼对饲料中苏氨酸的最适需求量分别为占饲料干重的1.84%、1.87%及1.83%,占饲料蛋白质的4.11%、4.18%及4.09%。     

半滑舌鳎含sox9基因BAC克隆的筛选及BAC-FISH定位

以本实验室构建的半滑舌鳎BAC文库为基础,通过对其进行有序混合,构建了两步PCR筛选体系;对性别决定相关的sox9基因的序列设计特异性引物,筛选获得阳性单一BAC克隆。利用BAC-FISH技术将包含sox9基因的BAC克隆定位在半滑舌鳎染色体上。结果显示,sox9基因在雌、雄半滑舌鳎的一对常染色体的长臂上分别存在两个杂交信号位点,信号稳定且特异。研究证实了该文库筛选体系的有效性;首次实现了对性别相关的sox9基因在半滑舌鳎染色体上的定位,其结果为揭示sox9基因参与鱼类性别控制的机制提供了重要基础。