集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803 slr1501的克隆及原核表达分析

组蛋白乙酰基转移酶上调表达与抗逆性有一定相关性。集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803 Slr1501是一个未知蛋白,预测其属于组蛋白乙酰基转移酶GNAT家族N-乙酰基转移酶。为了进一步明确slr1501基因功能,本研究从集胞藻6803中克隆slr1501基因,成功构建了pET-28a(+)-slr1501原核表达载体,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行分析。经1 mmol/L IPTG诱导2 h后Slr1501蛋白成功表达,表达量随诱导时间的延长而增加,且主要以包涵体形式表达。Western blot检测结果显示Slr1501重组蛋白特异性表达。本试验结果为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

牦牛CRH基因克隆及其在生殖轴中的表达研究

为了探讨促肾上腺皮质激素释放激素（corticotropin-releasing hormone，CRH）基因在牦牛繁殖中的调控作用，试验分别采集5头成年母牦牛和5头成年母黄牛的下丘脑、脑垂体前叶、输卵管、卵巢和子宫等组织，通过RT-PCR技术及生物信息学软件对牦牛CRH基因编码区进行扩增、克隆及序列分析，并构建系统进化树；采用实时荧光定量PCR法检测CRH基因的组织表达。结果表明，牦牛CRH基因编码区全长573 bp，编码190个氨基酸。牦牛与黄牛、猫、鸡、人、小鼠、大鼠和猪的CRH基因核苷酸同源性分别为99.8%、43.3%、36.1%、46.2%、39.0%、38.5%和56.4%。系统进化树表明，牦牛与黄牛亲缘关系最近，并与其他物种类聚，符合物种进化规律。CRH蛋白分子式为C₉₂₀H₁₅₀₃N₂₇₉O₂₆₃S₃，分子质量为20776.95 u，理论等电点为10.95，其氨基酸组成中亮氨酸（L）、脯氨酸（P）、丙氨酸（A）和精氨酸（R）所占比例较高，分别为15.8%、12.6%、12.1%和10.5%。CRH蛋白为不稳定亲水蛋白，存在信号肽和跨膜结构。CRH蛋白二级结构中α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲分别占41.05%、1.05%、8.42%和49.48%，三级结构分析结果与其相一致。CRH基因mRNA在牦牛下丘脑中表达量最高，显著高于其他组织（P<0.05），在子宫中表达量最低。牦牛脑垂体前叶CRH基因mRNA表达量极显著高于黄牛（P<0.01），在卵巢、输卵管中表达量显著高于黄牛（P<0.05），而两个品种在下丘脑、子宫中的表达量差异不显著（P>0.05）。提示CRH基因在牦牛繁殖调控中具有重要作用。     

芹菜水孔蛋白基因AgPIP2;1的克隆及其对非生物胁迫的响应

为了研究芹菜质膜内在蛋白基因的序列特征及其在非生物胁迫条件下的表达特性,探讨其抗逆功能,以芹菜品种六合黄心芹为试验材料,通过RT-PCR技术克隆AgPIP2;1基因,通过生物信息学软件分析其核苷酸和氨基酸序列特征,并采用荧光定量PCR技术检测其在不同组织的表达及其对非生物胁迫的响应。结果表明,AgPIP2;1基因含有1个861 bp的开放阅读框,编码286个氨基酸,其编码的蛋白属于PIP2类蛋白。氨基酸序列分析显示,AgPIP2;1含有高度保守的NPA基序以及高等植物PIP蛋白的保守序列,与其他物种PIP2类蛋白具有较高的同源性,与胡萝卜DcPIP2;1的氨基酸序列同源性达到97.90%。在亲缘关系上与大豆GmPIP2;1、胡萝卜DcPIP2;1和绿豆VrPIP2;1较为接近。实时荧光定量PCR技术分析表明,AgPIP2;1基因在芹菜根、叶柄和叶片中均有表达,其中在叶片中的表达量最高,在根中的表达量最低,呈现比较明显的组织特异性。此外,AgPIP2;1基因受到高温、低温、干旱和盐等非生物胁迫的诱导,说明该基因可能参与芹菜抵御非生物胁迫的过程。本研究为进一步了解AgPIP2;1基因的功能及其在非生物胁迫中的作用奠定了基础。     

茶树CsSNAT基因的克隆与表达分析

为明确茶树SNAT基因的序列特征和表达特点,在茶树转录组测序的基础上以茶树(Camellia sinensis)品种舒茶早为试验材料,通过SMART^TM RACE技术克隆茶树褪黑素合成途径中关键限速酶5-羟色胺-N-乙酰转移酶CsSNAT基因的cDNA全长序列,并分析其基因结构和表达模式。结果表明,CsSNAT基因序列全长1 014 bp,其中包含742 bp的完整开放阅读框(ORF),编码247个氨基酸,预测等电点7.64,蛋白分子量27.36 kDa。氨基酸序列比对显示,CsSNAT蛋白与其他高等植物的SNAT蛋白具有较高同源性,与葡萄 VvSNAT(CBI31163)同源性最高,为66.19%。诱导蛋白最佳条件为温度28℃,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度0.5 mg·L^-1,诱导时间6 h,在上清液中可获得大量分子量为66 kDa的可溶性融合蛋白。实时定量 PCR 分析表明,CsSNAT在褪黑素处理6 h后表达量最高,为对照的3倍;茶尺蠖取食6 h后,CsSNAT表达显著上调。不同激素处理结果显示,CsSNAT受脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)和水杨酸(SA)诱导表达。本研究结果为5-羟色胺-N-乙酰转移酶功能研究奠定了一定的基础。     

山葡萄VaCIPK18原核表达与多克隆抗体制备

类钙调磷酸酶B亚基蛋白(CBLs)互作蛋白(CIPKs) 作为类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在植物响应非生物胁迫信号转导中起着重要作用。基于前期山葡萄响应低温胁迫转录组测序结果,发现低温胁迫引发的早期伤害及感知阶段的激酶基因中涉及CBL-CIPK 信号通路的VaCIPK18表达显著上调。为进一步研究山葡萄(Vitis amurensis)VaCIPK18激酶参与低温胁迫的功能,采用同源克隆获得了VaCIPK18基因,其开放阅读框为1 320 bp,编码439个氨基酸。基于对VaCIPK18蛋白生物信息学分析,获取胞外结构域中抗原表位丰富的肽段,并将其C端调控结构域(230~439 aa)构建到原核表达载体pET28a-SUMO。将重组表达载体转化至大肠杆菌(E. coli Rosetta)中,经0.8 mmol·L^-1 IPTG、37℃诱导4 h表达出大小为42 kDa的包涵体蛋白。将重组蛋白作为抗原免疫日本大耳白兔,获得anti-VaCIPK18多克隆抗体,经检测具有高效价及特异性。Western Blot结果表明,该抗体可以与葡萄内源CIPK18特异性结合,且在50 kDa位置出现与预期一致的条带。同时,CIPK18在低温胁迫后葡萄叶片中蛋白表达水平与室温下相一致,但两种状态下均存在可能的磷酸化与泛素化修饰现象。本研究结果为进一步探究VaCIPK18的蛋白定位、表达及其功能奠定了基础。