魁蚶C型凝集素基因cDNA的克隆及表达分析

通过cDNA末端快速扩增(Rapid amplification of c DNA ends,RACE)技术克隆得到魁蚶(Scapharca broughtonii)C型凝集素(C-type lectin,Sb-Lec1)基因,该基因全长为700 bp,其中,5′-UTR为29 bp,3′-UTR为167 bp,开放阅读框长度为504 bp,编码167个氨基酸,包括长度为23个氨基酸的信号肽序列、129个氨基酸的糖识别结构域(CRD)以及参与二硫键形成的6个半胱氨酸。预测蛋白分子量为19.11 k Da,理论等电点为4.74。多序列比对结果显示,Sb-Lec1基因CRD编码的氨基酸序列与长牡蛎(Crassostrea gigas)、紫贻贝(Mytilus galloprovincialis)和海湾扇贝(Argopecten irradians)C型凝集素的同源性分别为38%~40%、34%~35%和38%~39%,Sb-Lec1基因编码的氨基酸序列与其他物种的凝集素基因具有相似的结构,均含有形成二硫键的4个保守半胱氨酸。系统进化分析结果显示,魁蚶先与贝类聚为一支,再与脊椎动物聚在一起,表明魁蚶Sb-Lec1基因在进化树上的位置与其传统分类所处位置一致。采用荧光定量PCR技术,检测了Sb-Lec1基因在组织中的表达情况,发现其在肝胰腺、血淋巴、鳃、外套膜、闭壳肌、斧足中均有表达,其中,肝胰腺表达量最高。同时,分析了Sb-Lec1基因在鳗弧菌(Vibrio anguillarum)刺激下的mRNA表达量变化情况。结果显示,与对照组相比,菌刺激组Sb-Lec1基因mRNA在各检测组织中的表达量均显著上调(P0.05),随着刺激时间的延长,表达量呈先升高后降低的趋势。本研究表明,魁蚶Sb-Lec1基因在机体免疫防御方面发挥重要功能。     

凡纳滨对虾氨氮急性胁迫应激敏感群体和耐受群体对WSSV敏感性的差异分析

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)是世界范围内举足轻重的水产养殖品种,在普遍的高密度养殖活动及环境恶化的情况下,逆境胁迫是影响其养成率的主要因素之一,其中,高浓度氨氮胁迫是最普遍的毒理因子。由于对虾抗病性状的遗传力较低,且在受限于测试场地的低选择强度情况下,抗病选育的进展比较缓慢。而对虾的抗逆性具有较高的遗传力,且不具备传染性的特点使得其不受测试场地的限制。因此,本研究以氨氮急性胁迫应激敏感群体(SP)和耐受群体(TP)为实验材料,对其进行白斑综合征病毒(WSSV)敏感性差异分析,首次探索了通过提高对虾对逆境急性胁迫应激的耐受性,从而间接提高其抗病力的可能性。本研究每个群体设3个处理:高浓度氨氮胁迫下(10 mg/L)WSSV感染组,两群体分别命名为SPAV和TPAV;正常海水条件下(氨氮水平小于0.01 mg/L)WSSV感染组,分别命名为SPV和TPV;正常海水条件无WSSV感染组(空白对照组),分别命名为SPC和TPC。结果显示,SP群体(5 h)在WSSV感染后开始死亡的时间显著早于TP群体(16 h);从感染60 h后,SPAV组的死亡率呈直线上升趋势,到137 h时该组全部死亡,其累积死亡率显著高于SPV(70.42%)和TP群体的2个组TPAV(42.67%)和TPV(18.99%)(P0.05)。在144 h实验结束时,SPV的累积死亡率为73.67%,显著高于TP群体的2个组TPAV(46.15%)和TPV(18.99%)以及SP群体的对照组SPC(34.79%);此时,TPAV组的累积死亡率显著高于TPV和TPC组(P0.05),而TPV与TPC组间无显著差异。研究表明,逆境毒理因子(氨氮胁迫)会增加对虾对病原的敏感性,而且对氨氮急性胁迫应激耐受力高的群体对病毒的抵抗力也高。本研究为探索提高对虾抗病力而降低养殖过程中的死亡率提供了新的思路和途径。     

三疣梭子蟹Drosha和Exportin 5基因克隆及其在性腺发育过程中的表达分析

本研究利用RACE技术克隆了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)Drosha和Exportin 5基因的cDNA全长序列,Drosha基因长度为3443 bp,编码1038个氨基酸,预测蛋白质包含2个相邻的RNA酶Ⅲ结构域(RⅢDa和RⅢDb)和1个双链RNA结合结构域(dsRBD)。Exportin 5基因全长为5000 bp,编码1208个氨基酸,预测蛋白质包含1个Importin-βN-末端结构域(IBN-N)和1个核输出蛋白结构域(XPO-1)。同源分析显示,三疣梭子蟹Drosha氨基酸序列与其他物种高度相似,与日本对虾(Marsupenaeus japonicus)相似度最高,达94%。qRT-PCR分析结果显示,Drosha和Exportin 5基因在三疣梭子蟹各组织中均有表达,其在卵巢和肝胰腺中的表达量最高(P0.05);在精巢不同发育时期,2个基因表达量的变化趋势一致,均在Ⅱ期(精母细胞增殖、分化期)表达量最高;在卵巢发育过程中,2个基因表达量的变化趋势也大致相同,随着卵巢发育(Ⅱ~Ⅴ期)逐渐升高。研究表明,Drosha和Exportin 5基因可能通过调控miRNA的合成来影响三疣梭子蟹性腺发育过程,为深入解析三疣梭子蟹性腺发育调控机制提供了重要参考。     

脊尾白虾翻译控制肿瘤蛋白基因TCTP克隆及自噬调控相关基因在卵巢发育期的表达

为深入了解脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)卵巢发育和卵黄蛋白原发生的分子机制,本研究克隆得到脊尾白虾翻译控制肿瘤蛋白基因TCTP,并结合自噬调控基因TCTP、Hif-1α、Beclin1和Bcl-2在卵巢发育期的表达水平,阐释脊尾白虾卵黄蛋白原合成过程中的分子调控特征。研究显示,脊尾白虾TCTP基因c DNA全长为732 bp,编码168个氨基酸,具有典型的TCTP1和TCTP2功能域以及PKC和TKⅡ等mTOR信号通路相关的磷酸化位点。同时发现,甲壳动物TCTP普遍缺乏在其他动植物中高度保守的C末端的cys残基。进化分析显示,脊尾白虾TCTP与中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)亲缘关系最近。4种自噬调控基因在脊尾白虾卵巢发育期的表达结果显示,肝胰腺TCTP基因从增殖期到产后恢复期呈递减趋势;肝胰腺Hif-1α、Beclin1和Bcl-2基因表达趋势相似,即从增殖期到小生长期高表达,大生长期极显著下降,表达量最低(P0.01),这与外源性卵黄蛋白原的合成趋势大致相反。这些自噬调控基因可能通过自噬作用共同调节外源性卵黄蛋白原的合成。卵巢TCTP基因在小生长期表达量最高;卵巢Hif-1α基因从增殖期到产后恢复期持续升高,这与内源性卵黄蛋白原表达趋势相似;卵巢Beclin1基因在大生长期表达量最高,与脊尾白虾卵巢Ec R表达趋势相似,与卵巢Bcl-2基因表达趋势相反,这些自噬调控基因可能通过自噬作用共同促进内源性卵黄蛋白的合成。本研究表明,自噬调控基因TCTP、Hif-1α、Beclin1和Bcl-2在脊尾白虾卵巢发育时期相互协调共同作用,可能通过自噬作用调节脊尾白虾卵黄蛋白原的合成和卵巢发育。     

脊尾白虾E75基因克隆及E75、ECR和RXR在不同蜕皮分期的表达分析

本研究在克隆脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)E75基因(EcE75,GenBank No.KY471317)的基础上,探讨了其在蜕皮过程中的作用,同时也探讨了克隆脊尾白虾的蜕皮激素受体基因(EcECR)和维甲酸X受体基因(Ec RXR)在不同蜕皮分期的表达特征。克隆的EcE75基因全长为3944 bp,包括2520 bp的开放阅读框(ORF)。该开放阅读框编码一个由839个氨基酸组成的蛋白质,分子量为92.307 k Da,理论等电点为7.48。EcE75蛋白包含1个C4锌指结构,1个配体结合结构域,并且有1个明显的跨膜螺旋。EcE75基因在进化上具有一定的保守性,与甲壳动物聚为一支,与三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)、黑背地蟹(Gecarcinus lateralis)、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)、中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)等亲缘关系最近。EcE75基因在脊尾白虾的各组织中均有表达,其中,眼柄中的表达量最高,卵巢次之。在不同蜕皮分期中,EcRXR与EcECR、EcE75的表达规律基本一致,生殖蜕皮前期和后期表达量都比生长蜕皮高。生长蜕皮和生殖蜕皮因为卵巢发育而存在明显不同,蜕皮激素对卵巢发育的刺激作用,通过EcECR、EcRXR和EcE75基因的表达上调可以体现出来。对EcECR、EcRXR和EcE75基因在不同蜕皮分期的表达研究,为了解虾蟹类蜕皮机制提供了参考信息。     

海带hsp70基因的克隆、分析及转录水平定量研究

本研究以海带(Saccharina japonica)‘海天1号’为材料,通过RACE-PCR方法获得海带hsp70(Sjhsp70)基因全长cDNA序列。序列分析表明,全长cDNA长度为3778 bp,含有1个2892 bp的开放阅读框,5'和3'非编码区的长度分别为101、785 bp。蛋白质氨基酸含量和理化性质分析显示,该蛋白为稳定蛋白。应用BLASTP程序对不同物种HSP70蛋白比较分析表明,海带与长囊水云(Ectocarpus siliculosus)的HSP70蛋白具有较高的同源性,用HSP70蛋白构建的进化树显示,海带与长囊水云聚为一类。二级结构预测该蛋白由963个氨基酸组成,包含35个α螺旋和25个β折叠。以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)HSP110蛋白三维结构3C7N为模板,在I-TASSER软件上预测海带HSP70蛋白的三维结构,预测的蛋白结构与3C7N的A链在折叠和二级结构方面非常类似。对Sjhsp70基因在温度胁迫下表达变化分析表明,高温对Sjhsp70的表达量具有显著影响,Sjhsp70在25℃、24 h胁迫条件时,表达量达到最大值。本研究为阐明海带HSP70蛋白特性及其应对环境胁迫的机理提供理论依据。     

一例日本囊对虾暴发性死亡的病原分析

为了阐明山东省潍坊市一对虾养殖场发生日本囊对虾暴发性死亡的原因,采用分子生物学检测方法,对发病对虾进行了白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)、桃拉综合征病毒(Taura syndrome virus,TSV)、黄头病毒(yellow head virus,YHV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)、传染性肌肉坏死病毒(infectious myonecrosis virus,IMNV)、偷死野田村病毒(covert mortality nodavirus,CMNV)及急性肝胰腺坏死病(acute hepatopancreatic necrosis disease,AHPND)7种病原的检测,且对发病对虾进行了常规组织病理学观察。同时采用16S r DNA细菌鉴定方法及浸泡回接感染实验对分离自发病对虾体内的可疑病原菌进行了分子鉴定及毒力测试。结果显示,发病对虾样品核酸检测呈现WSSV强阳性,IHHNV和CMNV为弱阳性,其他4种病原为阴性。组织病理学观察发现,在对虾的胃、鳃等上皮组织中存在WSSV包涵体,头部肌肉纤维出现离散。对分离编号为2901、2902、2903的3株优势可疑病原菌鉴定结果显示,3株菌分别与印度格里蒙菌、交替单胞菌及溶藻弧菌相似,相似度分别为99%、99%及100%。攻毒结果显示,3株可疑病原菌的LC50分别为9.8×107、1.1×108与2.3×108 CFU/m L,各细菌毒力均较弱,非导致对虾出现暴发性死亡的病原。研究表明,导致本次日本囊对虾暴发性死亡的病因与混合感染病原WSSV、IHHNV、CMNV有关,其中WSSV感染是造成日本囊对虾暴发性死亡的主因,研究结果可为解析当前养殖日本囊对虾疾病暴发及其成因提供参考。     

不同健康程度和抗生素氟苯尼考干预下斑石鲷肠道菌群的结构差异

为了研究不同健康程度和抗生素氟苯尼考干预下斑石鲷肠道菌群结构的差异及其与养殖环境中菌群结构的相关性,采用Illumina Hi Seq PE250高通量测序的方法对健康、亚健康、典型黑身病和口服氟苯尼考条件下的斑石鲷肠道、养殖水体和颗粒饵料中的细菌多样性及群落结构进行了分析比较。结果显示,养殖水体中细菌多样性高于肠道和颗粒饵料。不同健康程度及氟苯尼考干预下斑石鲷肠道中细菌均以变形菌门、厚壁菌门和软壁菌门为主,且对应的操作分类单元(OTU)占样品全部OTU的比例均达到85%以上。黑身病的发生可影响斑石鲷肠道中丰度最高的前20种优势细菌种类的排名次序,其中变形菌门中的弧菌属的相对丰度显著增加,且随着弧菌属丰度的增加,斑石鲷的黑身病症状也逐渐加重。饵料中添加氟苯尼考投喂斑石鲷能使患病鱼肠道弧菌属的丰度从60.33%下降到1.29%,较大程度改变了肠道的菌群结构,并证实氟苯尼考有效防治黑身病。其次,养殖水体和颗粒饵料对斑石鲷肠道菌群也有一定影响,且养殖水体的影响高于颗粒饵料。本研究首次报道了斑石鲷肠道菌群结构,其研究结果为今后斑石鲷的健康养殖、疾病防控及其微生态学研究提供了参考依据和技术支撑。     

莱州湾头足类的群落结构及其与环境因子的关系

为了掌握莱州湾头足类的资源现状,根据2011—2012年进行的9个月份的底拖网调查数据,研究了莱州湾头足类的群落结构及其与环境因子的关系。结果显示,148网次共捕获头足类6种,隶属于3目、3科、4属。头足类生物量及个体数均以10月最高、3月最低,周年平均值分别为3 111.39 g/h和723.54个/h。枪乌贼为莱州湾头足类的绝对优势种,其周年的相对重要性指数为13 097。头足类个体数的空间分布随月份变化,6—7月以莱州湾中南部密度较高,8—11月以莱州湾中北部密度较高,3—5月头足类的密度整体较低。CLUSTER和MDS分析将9个调查月份分为4个群组,ANOSIM分析显示群组两两间的群落结构均呈显著性差异,SIMPER分析表明枪乌贼对群组区分的贡献最大。头足类的个体数分布与浮游动物密度的相关性最高。生殖洄游和越冬洄游是影响莱州湾头足类空间分布季节变化的首要因素。研究结果可为莱州湾头足类资源的可持续利用和保护提供科学依据。     

海蜇Frizzled1基因的克隆及在无性繁殖中的表达

采用RACE技术解析了海蜇(Rhopilema esculentum)Frizzled1基因的cDNA和基因组结构:Re-Fzd1基因的全长cDNA为2387 bp,其中编码区为1761bp,编码586个氨基酸的多肽。SMART分析表明,Re-Fzd1基因具备Fzd家族共同的结构特征,包括:一个由23个氨基酸组成的信号肽,一个位于N-末端富含10个保守半胱氨酸残基的半胱氨酸富集域(CRD),一个含有7个跨膜片段的跨膜结构域,以及一个含有5个重要的磷酸化位点的C端尾巴。多序列比对表明,Re-Fzd1基因与刺胞动物贝螅(Hydra echinata)、水螅(Hydra vulgaris)、半球美螅水母(Clytia hemisphaerica)和海葵(Nematostella vectensis)Fzd1具有高度相似性,与来自脊椎动物人(Homo sapiens)、鼠(Mus musculus)、爪蟾(Xenopus laevis)和斑马鱼(Danio rerio)的Fzd1、Fzd2和Fzd7家族基因也具有较高的同源性。基于N-J法,将人、鼠、爪蟾、斑马鱼和果蝇(Drosophila melanogaster)所有Fzd家族基因系统进化分析显示,除果蝇外,所有Fzd家族成员聚类成4个类群,11个亚家族,海蜇Re-Fzd1基因首先与刺胞动物门的Fzd1聚类在一起,然后与脊椎动物Fzd1、Fzd2和Fzd7三个家族聚成一个类群,表明脊椎动物Fzd1、Fzd2和Fzd7家族可能与刺胞动物门的Fzd1起源于同一个共同祖先。Re-Fzd1基因组序列中不含有内含子。实时荧光定量PCR结果显示,Re-Fzd1基因在海蜇无性繁殖的4个发育阶段均有表达,其中,表达量最高的横裂体阶段是表达量最低的稚水母阶段的3.67倍。整体原位杂交显示,在海蜇横裂体时期,Re-Fzd1原位表达在触手、基座及发生横裂的部位。这些结果都表明,Re-Fzd1不但参与了海蜇的早期发育过程,还调控了海蜇无性繁殖的发生。