H5N1 和 H9N2 亚型禽流感病毒HA基因的原核表达

采用自行设计的引物,通过PCR的方法,分别从pMD-HA5和pMD-HA9中成功扩增出AIV 0025(HSN1)株和KMⅢ(H9N2)株的血凝素(hemagglutinin,HA)基因,然后分别亚克隆到pET-32a( )、pET-28a( )表达载体中,构建并筛选出阳性重组子,分别标记为pET32-HA5、pET28-HA9.将阳性重组质粒转化进B121(DE3)宿主菌中,通过改变IPTG浓度和诱导时间,使重组蛋白获得表达,并确定了最佳诱导条件为IPTG终浓度1.0 mmol/L、诱导时间4～5 h.经SDS-PAGE和 Western-blotting 分析表明,重组蛋白相对分子质量约为85 000和63 000,主要存在于包涵体中,具有良好的免疫学活性.     

PEDVN蛋白单克隆抗体的制备及间接免疫荧光检测方法的建立

【目的】制备猪流行性腹泻病毒(PEDV) N蛋白单克隆抗体,并建立检测PEDV的间接免疫荧光试验方法。【方法】以重组表达的PEDV N蛋白为免疫原,免疫8周龄雌性BALB/c小鼠,分离高抗体效价小鼠的脾细胞,与SP2/0细胞融合。筛选分泌抗PEDV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。在已经感染PEDV的Vero细胞中,以抗PEDV N蛋白的单克隆抗体为一抗,FITC-羊抗鼠IgG为二抗,建立PEDV的间接免疫荧光检测方法。【结果】制备的杂交瘤细胞株可以稳定分泌抗PEDV N蛋白抗体,细胞上清液的ELISA抗体效价在1∶3 200以上,而诱导的小鼠腹水抗体效价在1∶1 000 000以上。将单克隆抗体应用在间接免疫荧光试验时,最适条件为-20℃80%(φ)丙酮溶液中固定30 min;一抗用PBS缓冲液按体积比1∶1 000稀释,4℃条件下过夜孵育;二抗用PBS缓冲液按体积比1∶100稀释,37℃条件下孵育1 h。以建立的间接免疫荧光试验方法检测细胞中的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PPRV)、猪肠道α冠状病毒(PEAV)、猪轮状病毒(PoRV)和PEDV,只有PEDV显示阳性,其他病毒均为阴性。【结论】制备了抗PEDV N蛋白单克隆抗体,以该抗体为一抗建立检测PEDV的间接免疫荧光试验方法具有良好的特异性,为PEDV的实验室检测及PEDV在培养细胞中的定位和动态分布提供了有效的手段。     

规模猪场生态循环模式的研究与建设实践

我国是世界第一养猪大国,随着规模化程度的提高,猪场废弃物所产生的环保问题日益加剧,规模化猪场迫切需要通过有效的治理途径,解决猪场废弃物的环境污染问题。生态循环种养模式是解决规模猪场环境污染的必由之路。本文在分析了生态循环模式的意义、当前国内外研究现状、存在的共性问题等基础上,介绍了生态循环模式的建设实践。     

新形势下高校生产实习质量保证体系研究——以华南农业大学兽医学院为例

生产实习是兽医人才培养的关键环节,华南农业大学兽医学院通过选择和建设合理的校外实习基地,完善实习管理制度,改革实习程序,建立合理的考核方式及激励机制,重视实习反馈及评价总结等方面构建了生产实习质量保证体系,为培养实用型、创新型兽医人才奠定基础。     

重组猪α干扰素治疗高致病性猪蓝耳病的研究

为了观察重组猪α干扰素对高致病性猪蓝耳病临床治疗效果,采用毕赤酵母表达系统高效表达的重组猪α干扰素制剂,按照农业部颁布的《高致病性猪蓝耳病防治技术规范》进行高致病性猪蓝耳病小量临床试验。结果表明,该制剂对高致病性猪蓝耳病的治愈率超过81%。     

副猪嗜血杆菌OmpA抗原表位预测、克隆及表达

运用生物信息学软件DNAStar对副猪嗜血杆菌S4型OmpA的二级结构、表面特性及抗原表位等进行分析，联合重组抗原表位基因片段，并对其进行密码子改造，人工合成改造后的基因片段。将其插入pET-32a构建重组表达载体pETpA，转化大肠杆菌BL21（DE3），进行诱导表达、鉴定及纯化。结果显示，OmpA胞外段的抗原表位分布于40～61、94～108、138～148、193～214氨基酸残基。重组后的表位基因序列与理论设计序列完全一致，表达产物为28000大小的融合蛋白且其能与兔抗Hpss4型多抗血清特异性地反应。融合蛋白经过柱纯化并经脱盐处理后质量浓度为4～40g／L。结果表明，成功构建表达OmpA多抗原表位的重组质粒pET—pA，并对融合蛋白进行分离纯化，为单克隆抗体的制备、检测方法的建立及疫苗的研制奠定了基础。     

种兔致病性大肠杆菌性腹泻病的诊断与防治

种兔致病性大肠杆菌性腹泻病的诊断与防治黄青云，郭霄峰（华南农业大学动物医学系，广东广州５１０６４２）广州郊区某种兔场，１９９３年３月发生一起种兔迅速死亡的腹泻，８７３只种兔发病死亡１５３只，造成严重损失，实验室诊断结果为致病性大肠杆菌性腹泻病，报告于...     

猪α-干扰素在毕赤酵母中的分泌表达和下游工艺的研究

通过小量发酵、摇瓶发酵、大量发酵,研究猪α-IFN在毕赤酵母中表达的下游工艺,微量细胞板法测猪α-IFN体外抗VSV、PRRSV、TGEV的活性.猪α-IFN抗VSV的活性达到4.04×10~6IU/L,在PK15上抗TGEV的活性为10~7～10~8IU/L,在Mare 145上抗PRRSV的活性为10~6～10~7lU/L.30℃诱导培养96 h、甲醇添加1%、pH值6.0、DO 20%、0.25%～0.4%甲醛灭活,获得高活性的、安全的IFN.仔猪免疫后临床症状正常,未出现病理学变化.猪α-IFN体外抗病毒活性高,发酵后的抗病毒活性未下降,免疫动物未产生临床症状和病理变化,可用于临床治疗病毒性疾病.     

H9N2亚型禽流感病毒M基因的克隆与序列分析

对分离自中国南方的H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Guangxi/KMⅢ/99(H9N2)的M基因进行克隆和序列分析。序列分析表明,该M基因全长1 027 bp,包含2个读码框,可分别翻译出M1和M22种蛋白质。M1由252个氨基酸残基组成,M2由97个氨基酸残基组成。与不同毒株比较,结果显示,该M基因与A/Chicken/Guangxi/10/99(H9N2)同源性为100%,当A/Chicken/Guangxi/9/99(H9N2)同源性为99%,与A/Chicken/Guangdong/5/97(H9N2),A/Chicken/Guangdong/11/97(H9N2)等中国分离株同源性达98%。     

猪细环病毒2型衣壳蛋白的原核表达及纯化

本试验通过在大肠杆菌中表达衣壳蛋白,确定最优表达条件并对其进行纯化。用PCR法扩增猪细环病毒2型（TTV2）ORF1抗原基因,定向克隆至质粒pGEX-4T-1中,获得重组质粒pGEX-4T-1-ORF1。经双酶切鉴定及测序正确后转化到BL21(DE3)工程菌中,获得衣壳蛋白大肠杆菌表达株。IPTG诱导表达,表达的重组融合蛋白经SDS-PAGE及Western blotting鉴定,并对影响重组蛋白表达的3个因素,即诱导时间、诱导温度和IPTG浓度进行优化,确定最优表达条件。重组表达质粒PCR及双酶切鉴定结果显示衣壳蛋白原核表达载体构建正确。重组融合蛋白分子质量约80 ku,主要以包涵体形式存在。37 ℃诱导5 h表达量最多,IPTG浓度对表达量无明显影响。蛋白质串联肽谱分析检测氨基酸序列与GenBank中公布的TTV2 ORF1基因序列翻译的氨基酸序列相对应,且可被鼠抗GST单克隆抗体特异性识别。该融合蛋白首次用KCl染色切胶回收法对表达的融合蛋白进行纯化,纯化效果较好,性价比高。结果表明,成功构建了pGEX-4T-1-ORF1重组质粒,衣壳蛋白得到了高效表达及纯化,为间接ELISA的建立及单克隆抗体的研制提供了抗原。