猪T细胞受体α链基因的克隆、序列分析及其结构预测

旨在为研究猪T细胞受体分子结构与功能,并首次在国内克隆了猪T细胞受体α链基因。以GenBank上登载的猪T细胞受体(Tcell receptor,TCR)α链(AB087988)为参考序列,从甘肃合作猪外周血液淋巴细胞中用RT-PCR的方法克隆了TCR-α链基因(pTCR-α)。结果表明:克隆的TCR-α基因具有完整的ORF,全长819 bp,编码272个氨基酸,预测蛋白分子量为30 kDa,含18个强碱性氨基酸,23个强酸性氨基酸,87个疏水性氨基酸和103个极性氨基酸,含有一段20个氨基酸的信号肽序列;与GenBank上登载的TCR-α参考序列(AB087988)的同源性为94.6%,与其他具有完整ORF的猪TCR-α相比,同源性为54.4%~80.3%。推测可能是一新的TCR-α基因转录本。同时,应用生物信息学技术分析了其基因序列及编码蛋白的结构特征,这为猪T细胞受体分子结构与功能的研究奠定了基础。     

猪圆环病毒2型甘肃兰州株全基因组序列的克隆及序列分析

参照GenBank中登录的猪圆环病毒2型(PCV2)全基因组序列,设计合成了2对特异性引物,从甘肃兰州疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)病料中提取PCV2基因组DNA,分段PCR扩增全长基因组。回收PCR产物,将其插入pGEM-T Easy载体,构建了重组质粒pGEM-PCV2,转化后筛选、提取阳性重组质粒进行测序。结果表明,克隆到的PCV2全基因组长为1767 bp。应用DNAStar序列分析软件对所测PCV2序列与GenBank中登录的包括甘肃在内的国内外PCV2毒株进行同源性分析。结果显示,克隆的PCV2与ZhouKou(EU656143)毒株遗传关系较近,其核苷酸和推导的氨基酸序列同源性高达99.4%、98.6%,与已报道的GS03(EU547458)甘肃毒株遗传关系较远,可能是流行于甘肃兰州的一个变异毒株GSLZ(GenBank登录号为:FJ447482)。     

蕨麻猪生长激素基因的同源性和多态性分析

为了探索蕨麻猪的遗传多样性,对蕨麻猪生长激素基因序列的多态性进行研究,并选择GenBank中14条序列作为比较研究对象;首次成功克隆了7条蕨麻猪生长激素基因,测出5条蕨麻猪生长激素基因DNA序列,其多态性是内含子1有1个转换和1个颠换;内含子2有2个转换。说明蕨麻猪之间的差异可能与内含子的控制有关。蕨麻猪与其他14种猪之间在编码区和非编码区共检测到核苷酸的变异为155个,内含子有119个,外显子有28个,5′端有8个。其中,颠换104个,转换14个,缺失23个,插入14个。出现碱基取代的位点中,大多数是颠换型突变,颠换与转换之比为7.43∶1,存在颠换偏倚现象。对蕨麻猪生长激素基因同源性百分数和趋异数分析,结果发现,蕨麻猪与小型猪相比同源性较近,蕨麻猪与大型猪同源性较远。蕨麻猪等15 种猪生长激素基因序列树状图分析,结果表明,蕨麻猪与Vize猪有较远的亲缘关系;蕨麻猪与贵州榕江香猪亲缘关系最近。     

猪带绦虫仓鼠动物模型的建立

 【目的】为开展猪带绦虫的病原学形态观察、生物学特性研究以及解决实验材料来源的问题,建立猪带绦虫的实验仓鼠动物模型。【方法】通过经口感染被免疫抑制的实验仓鼠,观察仓鼠体内绦虫的感染、生长发育及寄生部位等生物学特性,并利用压片技术和组织切片技术对检出的绦虫的形态结构进行研究。【结果】免疫抑制剂在5 mg/只,感染一次就能使囊尾蚴发育到性成熟;在实验仓鼠体内,感染后40 d的仓鼠体内就能检出具有体节的可见虫体,感染80 d后的仓鼠体内能检出孕卵节片;检出的虫体多数吸附在小肠前1/3段,也有寄生在胆囊和胆管中的虫体,甚至偶见虫体钻出胆囊外堆积在肝脏附近;虫体头节上可见4个吸盘及两圈小钩;与人猪带绦虫相比,成熟节片较少。【结论】成功建立了猪带绦虫仓鼠动物模型,这使得成功解决猪带绦虫实验材料的来源问题成为可能,也为猪带绦虫的深入研究奠定了基础。     

猪白细胞介素-4基因的克隆与表达

利用RT-PCR技术,从被刺激诱导的PBMC中克隆IL-4基因,序列分析表明:克隆的猪IL-4基因序列与GenBank上登录的IL-4基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99%和97.8%.然后用表达型引物从T载体上扩增IL-4基因,双酶切PCR产物后与表达载体pGEX连接,构建重组表达质粒pGEX-IL-4,用IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析表明,表达出38 ku融合蛋白,占菌体总蛋白的30%以上,并且以包涵体的形式存在,这为猪重组IL-4规模化生产和疫苗佐剂的研制奠定了基础.     

猪带绦虫六钩蚴免疫原基因的克隆、表达与结构预测

从猪带绦虫六钩蚴cDNA表达文库中筛选、克隆的Ts01基因，设计表达性引物，亚克隆到pGEX-4T-1表达载体，构建了pGEX-GST-Ts01的融合表达重组载体，转化BL21寄主菌和IPTG诱导表达后，经SDS-PAGE和Western蛋白分析．表明成功地高效表达了约40000右的融合蛋白质．与预测的相对分子质量大小一致，表达量达40％左右。表达产物具有免疫学活性，而且呈可溶性，未形成包涵体，这与用蛋白质软件分析的Ts01编码蛋白水溶性相一致。     

猪白介素-18基因的克隆及其序列分析

通过对猪PBMC刺激诱导，提取总RNA，然后采用RT-PCR技术克隆了猪白介素-18(plL-18)基因。序列分析结果表明，克隆的plL-18基因序列与GenBank上登录的plL-18基因序列完全一致，与其他各物种的IL-18基因间具有较大的种属差异性。该基因在国内的成功克隆为IL-18的进一步研究和开发奠定了基础。     

猪囊尾蚴T24基因的克隆与表达

采用RT—PCR方法扩增猪囊尾蚴T24免疫原基因，将扩增产物与pGEM—Teasy载体连接，重组质粒经PCR、酶切鉴定后进行测序；构建T24基因的pGEX-4T-1原核表达载体，经IPTG诱导表达后，进行SDS-PAGE、Western—blotting；用所表达的蛋白免疫小鼠，经ELISA检测血清抗体，验证其免疫原性。结果显示，所克隆的T24基因片段长716bp，含有1个678bp的开放阅读框，其编码226个氨基酸，与已报道的猪囊虫T24基因核苷酸序列同源性为100％；表达的融合蛋白大小为40ku，并能被猪囊虫阳性血清识别；免疫小鼠在免疫1周后即可检测到血清抗体，第30d达到较高水平，表明该融合蛋白具有较好的免疫原性。     

猪带绦虫dUTPase基因真核载体的构建及其在BHK细胞中的表达

采用PCR技术从重组克隆载体pGEM-dUTPase中扩增出猪带绦虫六钩蚴dUTPase基因,与表达载体pGFP-C1相连接,构建重组表达质粒pGFP-C1-dUTPase,转化大肠埃希菌DH5α,经测序证实,基因序列完全正确.用脂质体法转染BHK细胞,采用荧光显微镜实时观察和RT-PCR技术确定目的蛋白的表达情况.结果表明,在转染重组质粒48 h后能观察到绿色荧光,表明在BHK细胞中成功地表达了猪带绦虫dUTPase与pGFP-C1的融合蛋白,为下一步重组dUTPase酶活性的研究奠定了基础.     

猪CD58分子基因克隆、表达及其结构功能预测

CD58在机体免疫系统中具有重要作用,本研究通过对人、绵羊CD58 mRNA序列比对,设计兼并引物,应用反转录PCR技术克隆猪CD58基因,并在大肠杆菌中进行原核表达,同时运用生物信息学方法对其核苷酸序列、编码的氨基酸序列以及蛋白结构进行预测。结果表明:克隆的猪CD58 cDNA全长800 bp,ORF为735 bp;将其在大肠杆菌中进行表达,产物可被CD58抗血清识别;序列比对结果显示猪、羊和人的CD58核苷酸序列及氨基酸序列同源性并不高,但蛋白结构预测表明三者蛋白结构非常相似,尤其是V区三维结构,这是异种动物淋巴细胞和红细胞发生黏附的分子基础。该研究为CD58作为疫苗佐剂或免疫调节药物在临床中的应用、进一步研究CD58分子结构及CD2-CD58复合物激活免疫系统的机理奠定了基础。