剑尾鱼感染嗜水气单胞菌的动态病理变化观察

对剑尾鱼感染嗜水气单胞菌的病理变化进行了全面细致的观察。结果显示：剑尾鱼感染发病呈急性过程，感染后10～15h为发病死亡高峰期；病理组织学变化以全身溶血性贫血和广泛的组织细胞变性、坏死为主；感染发病死亡时间主要集中在5～24h，感染部位和鳃最先受到损伤，最终因各器官结构破坏、功能衰竭和窒息而亡。     

应用DGGE技术比较池塘人工生物膜与水体微生物多样性差异

[目的]为改善养殖的微生态环境提供参考。[方法]以无纺布为载体材料,采用PCR-DGGE技术比较了生物膜和水体微生物多样性的差异。[结果]电泳分析表明,总共检测到46条不同的条带。第4天,生物基与水体样品的条带数差异不明显。第8天时,二者出现了不同条带。在10~18天,生物膜多样性指数一直低于水体,直到第18~20天才开始高于水体。第12天时生物膜上优势菌种普遍存在,但是部分开始出现衰减和增强的趋势。Band1、5、6分别是生物膜上第8、12、16天出现的特征性条带,除假单胞菌属外,其他结果均为未得到分离培养或者未经过命名的菌类。水样中的特征条带Band3、4同爱德华菌、弧菌属的相似性分别为94%、87%。[结论]生物基载体可以改善池塘生物多样性。     

鳜致病性嗜水气单胞菌GYK1株的鉴定、毒力及溶血性

从患溃疡病的鳜肾脏中分离出一株病原细菌编号为GYK1。此株病菌人工感染鳜、银鲫、剑尾鱼,实验鱼出现出血、肌肉坏死或溃疡症状;腹腔注射攻毒,对鳜、银鲫、剑尾鱼、小鼠的半致死剂量(LD50)分别为8.33×104、1.06×105、1.26×105、1.05×106CFU/g;菌培养液上清能溶解鳜、加洲鲈、银鲫、小鼠、兔、绵羊、人O型血等的红细胞,在绵羊血平板上为β 溶血,不同代次和保存条件的细菌溶血性稳定。细菌在电镜下的形态、生化特性和ID32E系统自动鉴定的结果均符合嗜水气单胞菌的特征;PCR扩增检测到嗜水气单胞菌特异性的毒力基因气溶素基因(aerA)209bp片段,进一步说明此株病原细菌为含有毒力基因的嗜水气单胞菌。实验结果表明,GYK1是一株毒力和溶血性均较强的嗜水气单胞菌。     

鳗鲡溃烂病病原的分离与鉴定

从广东深圳患溃烂病的病鳗肝脏分离到一株致病性细菌AnGS020501。该菌的主要特征为:革兰氏阴性,端生鞭毛,TCBS平板上生长,氧化酶阳性,葡萄糖发酵型,对弧菌抑制剂O/129(50μg/片)敏感。通过常规细菌学方法和应用ATB细菌自动鉴定仪,鉴定该菌为创伤弧菌(Vibrio vulnificus)。人工感染实验结果证明,该菌是鳗鲡溃烂病的病原菌,对鳗鲡、罗非鱼、鲫、斜带石斑鱼和小鼠的半数致死量(LD50)分别为2.69×105、1.64×105、4.23×105、6.1×106、1.56×106CFU/g。该菌胞外产物对鳗鲡的LD50为1.02μg蛋白/g鱼体重。药敏试验结果表明:诺氟沙星、庆大霉素、四环素、多西环素及利福平等对该菌有显著的抑制作用。     

鳜养殖池塘底泥脱氢酶活性测定方法的研究

对鳜养殖池塘底泥脱氢酶活性的测定方法中的反应条件(反应温度、反应时间、萃取剂、萃取时间和缓冲液的pH等)进行了研究.结果表明:在反应时间为30 min,缓冲液pH为8.4,反应温度为37℃,萃取剂为乙酸乙酯,样品萃取时间为1 h的条件下,对4个底泥样品中脱氢酶活性的重复测定结果显示,该方法有较高的精密度(变异系数≤5.89%).     

3月龄草鱼种免疫器官组织学及其免疫后免疫基因的转录差异

为研究处于同一时期但养殖条件不同的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)鱼体规格与发育状态间是否具有一致性,观察压塘3月龄草鱼与普通3月龄草鱼头肾、中肾、肠道和脾脏的显微结构,并对压塘3月龄草鱼与普通3月龄草鱼进行腹腔注射疫苗处理,实时荧光定量PCR检测免疫7 d后、14 d后各期草鱼头肾、中肾、肠道和脾脏中IgM与MHCⅠ的表达量。结果显示,压塘3月龄草鱼各组织发育较普通3月龄草鱼迟缓。压塘3月龄草鱼与普通3月龄草鱼在免疫后,头肾、中肾、肠道与脾脏中IgM和MHCⅠ的表达量均有上升,且IgM与MHCⅠ的相对表达量峰值均出现在普通3月龄草鱼免疫14 d后的中肾中(IgM为74.51倍;MHCⅠ为56.02倍。结果表明,草鱼出血病活疫苗可以增强草鱼头肾、中肾、肠道和脾脏中IgM和MHCⅠ的表达,且在3月龄时期进行注射免疫效果最佳。     

斜带石斑鱼浸泡免疫哈维氏弧菌灭活疫苗后MHC-Ⅱ类分子的表达变化

为研究斜带石斑鱼浸泡免疫哈维氏弧菌全菌灭活疫苗后,MHC-Ⅱ类分子在鳃、皮肤、脾脏、头肾和后肠中的转录水平以及皮肤黏液和血清中的抗体滴度变化,并分析其相关性。应用荧光定量PCR和ELISA方法分别检测了斜带石斑鱼加强免疫后的2、4、7、11、14、21、28 d,5种组织中MHC-Ⅱ类分子的转录水平、皮肤黏液及血清抗体滴度随时间呈现的变化趋势。研究结果表明,以浸泡方式进行免疫,5种组织中MHC-Ⅱ类分子表达均呈现不同程度上调,其在鳃和皮肤中显示相似的动态变化,与黏液抗体滴度的变化相似。     

实时荧光定量PCR检测鲫鱼IgM mRNA方法的建立

建立了SYBR greenⅡ实时荧光定量PCR检测鲫鱼IgMmRNA水平的方法,即构建鲫鱼IgM标准品质粒,10倍稀释质粒标准品,建立标准曲线,进行熔解曲线分析和稳定性分析。结果表明,Ct值线性范围为5.8～25.4,相关系数为1;熔解曲线峰值单一,Tm为85.62(±0.13)℃;组内变异系数CV为0.18%～1.07%,组间变异系数为0.31%～2.31%。该方法具有检测范围广、扩增效率高、特异性好、重复性和稳定性良好等特点。     

草鱼出血病发生风险半定量评估模型的构建

本研究通过调查、分析草鱼出血病发生的各种风险因素,初步构建该病发生的风险评估模型,旨在为防控疾病提供决策依据。该模型包括由层次分析法构建的指标体系,以德菲尔法确定的各风险因素权重,由综合评价法表述的风险评估结果。构建的草鱼出血病风险指标体系包括9个目标层,即鱼种(B1)、免疫(B2)、水质(B3)、放养密度(B4)、水温(B5)、饲养管理(B6)、发病史(B7)、天气(B8)、池塘状况(B9);26个风险指标层,主要包括如鱼种是否带毒(C1)、是否免疫(C4)、免疫时健康状况(C6)、放养密度(C13)、水温(C14)、近年来发病情况(C19)等。目标层风险因素权重值集合为W={0.167;0.202;0.124;0.109;0.101;0.097;0.092;0.081;0.064},其中免疫和鱼种权重值最高。采用综合评价法表示风险评估结果,其函数模型为,ij ij得出华中地区、西南地区和华南地区发生草鱼出血病的风险值分别是0.699、0.690、0.568,与实际调查结果相符,即采取免疫接种措施后华南地区发生草鱼出血病的风险较华中和西南地区低。     

用Protein A亲和层析法快速分离纯化鲫血清IgM方法的建立和应用

采用Protein A亲和层析法对鲫Carassius auratus血清中的IgM进行快速分离纯化,所得产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹（Western blotting）进行分析检测。结果表明：采用Protein A亲和层析法可以很好地分离到高纯度的鲫血清IgM,电泳条带中重链和轻链清晰可辨,重链、轻链的相对分子质量分别为85 000、25 000左右,无明显杂带;利用纯化的鲫血清IgM免疫小鼠,获得了高效价抗IgM抗血清,可以特异性识别鲫血清和黏液中IgM重链。应用间接ELISA方法对浸泡免疫后的鲫血清和皮肤黏液中抗体的动态进行检测,结果显示：鲫皮肤黏液中的抗体滴度在免疫后第6天达到峰值,血清中抗体滴度在免疫后第15天达到峰值,前者高峰期出现较早,但持续时间短,后者高峰期出现较晚,但持续时间较长。本试验中所建立的Protien A亲和层析法为鱼类抗体制备、病原检测及免疫学相关研究提供了一种便捷的方法。