莲藕中甘薯潜隐病毒实时荧光定量PCR检测技术的建立及应用

甘薯潜隐病毒莲藕分离物（sweet potato latent virus-lotus，SPLV-lotus）在江苏省莲藕产区普遍引起发病，并且该分离物序列与已报道的SPLV甘薯分离物存在较大差异。为进一步监测SPLV-lotus在莲藕上的发生情况，针对SPLV-lotus的CP基因设计并优化特异性引物QSPLV-lotus3-F/QSPLV-lotus3-R，通过优化引物浓度和退火温度条件，构建标准曲线，建立了SPLV-lotus实时荧光定量PCR（Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）检测技术。该方法特异性强，可以快速检测出SPLV-lotus，灵敏度为普通PCR的100倍，可广泛应用于脱毒莲藕SPLV-lotus的精确检测。     

不同开口饵料对半刺厚唇鱼仔鱼摄食、生长与成活的影响

在水温23～25℃下,将刚开口摄食的5日龄半刺厚唇鱼Acrossocheilius hemispinus仔鱼饲养在60cm×50cm×50cm玻璃缸中,密度为300尾/缸,投喂淡水轮虫(10ind./mL)、水蚯蚓浆(过150μm筛网)、蛋黄(250μm纱布揉洗)、鱼苗开口料和虾奶粉,以筛选半刺厚唇鱼仔鱼的适宜开口饵料。22d的饲养结果表明:摄食不同饵料的半刺厚唇鱼仔鱼的初次摄食率、生长速率和成活率差异显著(P0.05),其中淡水轮虫组初次摄食率最高(98.89%),生长速率最快(日增全长0.43mm),存活率97.33%;水蚯蚓浆组初次摄食率亦达到95.56%,平均日增全长为0.36mm,存活率为85.44%;蛋黄组虽然初次摄食率(90.00%)较高,但其生长速率(日增全长0.13mm)和成活率(57.00%)均较低,显著低于淡水轮虫组和水蚯蚓浆组(P0.05);而开口饲料组和虾奶粉组的初次摄食率和成活率均显著低于其他3组(P0.05)。总之,淡水轮虫是半刺厚唇鱼仔鱼的最适开口饵料;水蚯蚓浆为适宜开口饵料,缺乏淡水轮虫时可用其替代作为半刺厚唇鱼仔鱼的开口饵料。     

山羊MC1R基因克隆、表达及其多态性研究

为研究黑色素皮质素受体1(MC1R)基因与山羊毛色形成的相关性,以苏淮山羊和波尔山羊为研究对象,克隆测序获得了山羊MC1R基因编码区全序列,实时定量荧光PCR(Real-Time PCR)检测其在苏淮山羊和波尔山羊耳组织中的表达水平,DNA池方法筛选其在山羊群体中的SNPs位点。结果发现,MC1R基因在苏淮山羊中全长954 bp,编码317个氨基酸残基。波尔山羊和苏淮山羊MC1R基因核苷酸和氨基酸序列一致性为99.79%和98.77%;系统进化分析发现,波尔山羊与苏淮山羊聚在一起后再与绵羊聚在一起。在苏淮山羊群体中发现183C/T和748T/G 2个突变位点,在波尔山羊群体中检测到701G/A突变。MC1R基因在波尔山羊耳组织中的表达水平高于苏淮山羊,但差异不显著。该研究显示MC1R基因可能在调控山羊毛色形成中发挥一定的作用。     

观点

面向世界农业信息技术发展前沿,面向国内现代农业发展的重大需求,当前和今后一段时期,农业信息技术的发展应以提高农业劳动生产率、资源利用率和土地产出率,促进农业发展方式转变为目标,加强人工智能技术与农业领域融合发展的基础理论突破、关键技术研究、重大产品创制、标准规范制定和典型应用示范,建立以“信息感知、定量决策、智能控制、精准投入、个性服务”为特征的农业智能生产技术体系、农业知识智能服务体系和智能农业产业体系,支撑农业生产经营方式实现“电脑替代人脑”“机器替代人力”“自主可控替代技术进口”三个转变,全面推进我国农业农村现代化进程。     

绝对定量分析不同条锈病抗性小麦品种根际细菌群落结构

[目的]分析不同条锈病抗性小麦品种根际细菌群落的结构和功能差异,为开发防治小麦条锈病的环境友好方案提供理论基础和创新思路.[方法]以同一地块中对条锈病具有不同抗性的4个小麦品种(抗病品种贵农19和华麦1223,感病品种002和I19)为研究材料,采集不同抗性小麦品种根际土壤样品,采用绝对定量扩增子分析技术,研究抗病和感病小麦品种根际细菌的群落结构和功能.[结果]同一地块的4个小麦品种条锈病病情指数具有明显差异.4个小麦品种根际土壤细菌群落结构绝对定量分析表明,感病与抗病小麦品种的根际细菌群落分别聚类成独立的两类.感病小麦品种根际细菌群落丰度和多样性显著高于抗病小麦品种根际细菌群落(P<0.05).坐标分析(PCoA)表明,所有小麦品种根际细菌群落按照抗病性不同分为两组;细菌群落功能分析表明,抗病小麦品种根际细菌群落具有更多的氨基酸和抗生素分泌功能.[结论]条锈病抗性对小麦根际细菌群落的影响超过小麦不同品种间遗传变异的影响.通过分析和挖掘不同条锈病抗性小麦品种的根际细菌群落,可开发出环境友好的小麦条锈病生物防治菌剂.     

塞内卡病毒和口蹄疫病毒二重实时荧光RT-PCR鉴别检测方法的建立

为了建立一种快速、敏感、特异的能够鉴别诊断口蹄疫病毒(FMDV)和塞内卡病毒(SVV)二重实时荧光RT-PCR方法,根据FMDV及SVV的保守基因序列,设计了2套特异性引物和不同荧光素标记的MGB探针。通过对PCR反应体系和反应条件的优化筛选,建立了FMDV和SVV二重实时荧光RT-PCR检测方法,并对二重实时荧光RT-PCR检测方法进行了特异性、敏感性、重复性试验;利用所建立的方法对98份疑似FMDV和SVV感染的临床样品进行了检测。结果显示,成功建立的FMDV及SVV二重实时荧光RT-PCR检测方法,模板在10~1～10~7拷贝/μL有很好的线性关系;对pGEM-T/FMDV和pGEM-T/SVV重组质粒出现阳性扩增信号,但对正常细胞培养物对照和其他7种病原对照未扩增出特异性曲线,方法特异性较好;最低检测模板浓度为10拷贝/μL;自98份疑似FMDV和SVV感染样品中检出9份FMDV阳性,10份SVV阳性,2份FMDV和SVV双阳性,并且和克隆测序结果一致。本研究建立的FMDV及SVV二重实时荧光RT-PCR检测方法,可用于FMDV和SVV的快速鉴别检测,为FMDV和SVV的鉴别诊断提供特异、敏感和高通量的方法。     

酿酒酵母细胞壁可通过TLR2受体调控绵羊瘤胃上皮细胞表达SBD-1

旨在研究酿酒酵母细胞壁对体外培养绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1(sheep beta-defensin-1,SBD-1)表达的影响及其调控途径,为揭示酿酒酵母细胞壁对机体免疫的调控机制提供理论依据。本研究将不同质量浓度的酿酒酵母细胞壁提取物(0,25,50,100,200,400mg/L)作用于绵羊瘤胃上皮细胞不同时间(0,2,4,8,12,24h)后,检测上皮细胞SBD-1和Toll样受体-2(TLR2)mRNA表达水平,并进一步通过TLR2阻断试验来证实TLR2是否介导酵母细胞壁促进SBD-1表达。结果表明,不同浓度的酵母细胞壁刺激瘤胃上皮细胞时,随着细胞壁浓度的增加SBD-1mRNA表达量呈先升高后降低的趋势,且酿酒酵母细胞壁质量浓度为200mg/L刺激12h时,SBD-1 mRNA表达量达到峰值,与对照组和其他时间组相比差异显著(P0.05);用质量浓度为200mg/L的酿酒酵母细胞壁刺激绵羊瘤胃上皮细胞不同时间,同样在12h时,TLR2的mRNA表达量达到最大;阻断试验表明TLR2可介导SBD-1的表达。本研究结果表明酿酒酵母细胞壁可促进绵羊瘤胃上皮细胞SBD-1的表达,且质量浓度200mg/L时,刺激瘤胃上皮细胞12h时SBD-1的表达量达到最高,而TLR2参与该调控过程。     

塞内卡谷病毒和口蹄疫病毒双重荧光RT-PCR检测方法的建立

为建立塞内卡谷病毒(SVV)和口蹄疫病毒(FMDV)的快速鉴别检测方法,本试验根据SVV 3D基因序列和FMDV 3D基因序列,分别设计探针和引物,建立了可同时检测SVV和FMDV的双重荧光RT-PCR法。结果表明,该方法特异性强,能准确检测出SVV核酸和FMDV核酸,与水泡性口炎病毒(VSV-IND和VSV-NJ)、猪水泡病病毒(SVDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)以及猪瘟病毒(CSFV)等病原核酸无交叉反应;灵敏度高,本试验中最低可检测到SVV和FMDV核酸质量浓度分别为1.35×10~(-5),1.68×10~(-5) mg/L。重复性好,Ct值变异系数小于4%。利用所建立方法对116份已知的临床样品进行检测,结果与参比方法一致。本试验建立的方法可用于SVV和FMDV的鉴别检测,为塞内卡病毒病和口蹄疫的诊断提供依据。     

兔病毒性出血症快速检测方法的建立

兔病毒性出血症是兔的1种传播性极强、致死率极高的重要传染病,针对性地加强该病原的进出境监测将对动物疫病防控具有重要的意义。本研究使用软件分析设计RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR的引物和TaqMan探针,建立了兔病毒性出血症RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR方法,并测定其特异性和敏感性。试验结果显示,只有阳性参照样品的DNA出现扩增,其他对照样品均未见扩增产物,证实这些检测方法具有良好的特异性。对阳性样品DNA进行10倍梯度稀释,再分别用新建的2种方法进行试验,结果显示兔病毒性出血症RT-PCR检测的DNA下限量为100 pg,实时荧光定量RT-PCR的DNA下限量为100 fg,2种方法都具有较高的敏感性。新建的RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR方法互补应用,有助于缩短检疫周期、提高检测效率,为出入境口岸部门加强入境试验兔或其他不同用途兔的疫病检测提供技术保障。