利用渗透压研究猪卵母细胞发育过程中核迁移规律

本研究采用高渗操作液(氯化钠)处理体外成熟卵母细胞。结果表明,发现培养42 h的卵母细胞,中期核与第一极体刚开始分离。培养44 h的卵母细胞,中期核与第一极体已经分离,达到15°。培养46 h的卵母细胞,中期核与第一极体之间的角度达45°。培养48 h的卵母细胞,中期核与第一极体之间的角度达到近90°,中期核开始向卵母细胞中迁移。经过高渗处理的卵母细胞经过后续操作后可以得到克隆个体。结果表明,利用体外成熟培养42~44 h的卵母细胞进行去核操作,可以达到近100%的去核效率,而不会影响胚胎的正常发育。     

亮甲酚蓝对猪卵母细胞体外成熟及核移植胚胎发育能力的影响

试验旨在研究亮甲酚蓝(brilliant cresyl blue,BCB)染色对卵母细胞体外成熟及后期胚胎发育潜力的影响。本研究利用13、26、39 、52 μmol/L BCB对成熟培养前的卵丘－卵母细胞复合体(cumulus-oocyte-complexes,COCs)染色90 min,比较各组卵母细胞的着色率、成熟率及孤雌激活胚胎和核移植胚胎的发育情况。结果表明,随着BCB浓度的增加,COCs着色率依次增加(20.00%、46.39%、51.66%和59.03%),但猪卵母细胞体外成熟率逐渐降低(74.03%、72.16%、70.53%和48.61%);不同浓度BCB染色后所得BCB⁺组卵的成熟率均明显高于BCB^-组。试验结果发现,BCB浓度在26 μmol/L时,经染色的COCs既有较高的着色率,且不影响其体外成熟的效率。基于此,研究选取26 μmol/L BCB作为最佳浓度对猪卵母细胞进行染色筛选,然后进行体外培养、孤雌激活及核移植试验。结果显示,筛选的BCB⁺组卵母细胞的孤雌胚和核移植胚的卵裂率和囊胚率均显著高于BCB^-组(P<0.05),而与对照组间无显著差异(P>0.05)。胚胎移植试验挑选BCB⁺组中发育较好的1-2细胞期重组胚对5头代孕母猪进行了移植,其中2头怀孕,1头顺利产下了6头健康胎儿。综合以上试验结果表明,利用BCB染色可作为一种有效的方法筛选体外成熟质量较高的猪卵母细胞,同时提高胚胎体外生产效率。     

6-DMAP对延边黄牛末期卵母细胞核移植的影响

为探讨6-二甲基氨基嘌呤（6-DMAP）在延边黄牛末期去核的体细胞克隆中的作用,本试验主要研究了单独使用离子霉素处理与离子霉素联合添加6-DMAP处理对体外成熟的老化延边黄牛卵母细胞的激活率的不同影响;以及不同时期添加6-DMAP对重构胚后期发育能力的影响。试验结果显示,体外成熟的老化卵母细胞,使用离子霉素单独处理后91%被激活,而在离子霉素联合添加6-DMAP处理后却没有细胞被激活,也就是没有第二极体的排出。另外,融合后使用6-DMAP处理,所得重构胚的囊胚发育率最低,而激活后的卵母细胞立即用6-DMAP处理,所得重构胚的发育能力与无6-DMAP处理的相近。综上所述,离子霉素联合添加6-DMAP可抑制老化的延边黄牛卵母细胞的激活,阻止第二极体的排出,但对重构胚的后期发育没有影响。而融合使用添加6-DMAP的培养液,抑制了重构胚的后期发育。     

体细胞核移植技术生产转入溶菌酶基因(hLYZ)牛胚胎的研究

本研究主要探讨经基因修饰和筛选后转基因供体细胞的挑选及处理对牛转入溶菌酶基因克隆胚胎早期发育的影响.用含人溶菌酶基因(human lysozyme,hLYZ)乳腺特异表达载体pEBH重组质粒转染高产荷斯坦牛成纤维细胞,经G418筛选后的转基因阳性细胞作为核供体细胞成功构建了转hLYZ基因克隆胚胎.结果发现,基因转染及筛选过程对转基因重构胚的发育有不利的影响,囊胚发育率显著降低;以注核针内径为参照,挑选直径为15～20μm的转基因阳性细胞作为供体细胞,重构胚的融合率和囊胚率较其它组差异显著(分别为80.4%和33.8%,P<0.05);生长旺盛期的细胞构建的转基因克隆胚的卵裂率及囊胚发育率显著高于经血清饥饿和生长接触抑制处理组(P＜0.05);所有的转基因克隆胚在体外发育的各个发育时期都能观察到绿色荧光蛋白的表达,但表达的强弱在不同个体及相同个体不同发育时期之间存在差异.随机挑选10枚囊胚以PCR法进行鉴定,结果全部为阳性转基因胚胎.研究结果表明,利用体细胞核移植方法可以获得转舰hLYZ基因的克隆胚胎,重构胚可成功的发育到囊胚阶段;挑选生长旺盛期的直径为15～20 μm的转基因阳性细胞作为供体细胞可显著提高转基因克隆胚的融合率和囊胚率.     

丁内酯-Ⅰ影响猪卵母细胞的体外成熟和发育能力

体外成熟的卵母细胞存在核成熟与胞质成熟不一致的情况,从而使得体外成熟的卵母细胞质量不高.本实验采用cdc2激酶抑制剂丁内酯-Ⅰ (butyrolactone Ⅰ,BL-Ⅰ)抑制猪卵母细胞核体外成熟,期望解决卵母细胞体外培养过程中细胞核与细胞质发育的不同步问题.结果表明,分别用0、10、20、40和80 μmol/LBL-Ⅰ处理猪卵母细胞44 h后,对卵母细胞成熟的抑制程度与BL-Ⅰ浓度的升高成正比.用20、40和80μmol/L处理时,处于生发泡(GV)期的卵母细胞分别为25％、47％和67％,与对照组(5％)相比差异极显著(P＜0.01);而到达MⅡ期的卵母细胞分别为38％、9％和0,与对照组(67％)相比差异极显著(P＜0.01).将20、40和80 μmol/L处理44 h后的卵母细胞,再在不含BL-Ⅰ的卵母细胞体外成熟培养液中培养44 h后,到达MⅡ期的卵母细胞为57％、41％和5％,与抑制44 h时相比均有显著差异,表明BL-Ⅰ对卵母细胞成熟的抑制作用是可逆的.20 μmol/L BL-Ⅰ抑制培养20 h再正常培养24 h(20 h++24 h-处理组)后卵母细胞的成熟率显著低于对照组(正常培养44 h)(65.6％vs 70.1％,P＜0.05).对20 h++24 h-处理组成熟的卵母细胞进行孤雌激活,其卵裂率、囊胚率和囊胚总细胞数均好于对照组,但无显著差异;对20 h++24 h-处理组成熟的卵母细胞进行核移植(NT),获得重构胚的卵裂率、囊胚率和囊胚总细胞数均优于对照组,并且卵裂率有显著差异(68.9％vs 62.4％,P＜0.05).结果提示BL-Ⅰ处理对猪卵母细胞的核成熟有明显抑制作用,这种抑制作用是可逆的,对猪卵母细胞孤雌胚胎发育能力和核移植胚胎的发育能力有一定的提高.     

Scriptaid处理可提高近交系五指山猪克隆胚胎的发育能力和克隆效率

为探讨一种新型低毒的组蛋白去乙酰化酶抑制剂Scriptaid处理克隆胚胎时对其发育能力和克隆效率的影响,本研究以近交系五指山小型猪胎儿成纤维细胞为供体细胞进行体细胞核移植构建重构胚胎,重构胚胎激活后培养在添加Scriptaid不同浓度（0～300nmol/L）的胚胎培养液中培养不同的时间（0～36h）,观察克隆胚胎的卵裂率和囊胚率,评价克隆胚胎体外的发育能力。实验结果发现100nmol/L Scriptaid处理24h组克隆胚胎的囊胚发育率（30.4%）较对照组（17.5%）显著提高,P〈0.05。将100nmol/L Scriptaid处理24h组克隆胚胎和对照组胚胎分别移植到4头受体母猪中,进一步观察其体内的发育能力。处理组克隆胚胎的受体在平均窝产仔数和克隆效率（分别为5头,2.4%）均显著高于对照组（分别为1.5头,0.7%）,P〈0.05。以上结果表明,100nmol/L Scriptaid处理24h近交系五指山小型猪克隆胚胎,有利于提高克隆胚胎的发育能力和克隆效率。     

哺乳类动物胚胎干细胞多能性和全能性研究进展

交ＥＳ细胞分离与克隆技术和分子生物学技术相结合就可将新的遗传物质导入家畜的生殖腺细胞。通过囊胚注入胚胎干细胞产生嵌合体小鼠表明对胚胎干细胞进行遗传操作是对物生殖细胞进行遗传改造的有效方法之一。     

成熟培养基对猪卵母细胞的影响

评估NCSU23和TCM199两种培养基对猪卵母细胞体外成熟、孤雌激活以及核移植重构胚发育的影响。分别以NCSU23和TCM199为基础培养基,向其中添加相同浓度的半胱氨酸、激素和生长因子,作为猪卵母细胞体外成熟培养液,培养44 h(5%CO2、39℃、饱和湿度),挑选第一极体;成熟后的卵母细胞进行孤雌激活和核移植重构胚操作,144 h后观察囊胚数。结果表明,NCSU23组与TCM199组对卵母细胞体外成熟(68.18%和67.55%)、孤雌囊胚率(38.40%和37.60%)与核移植囊胚率(23.79%和21.38%)无显著影响(P>0.05),但是两者对孤雌囊胚细胞数的影响差异显著(分别为38.4和37.6个细胞)(P<0.05)。NCSU23成熟培养基能够使胞质成熟完全,提高囊胚细胞数,有利于妊娠的发生。可见,以NCSU23为基础培养基的体外成熟液有利于猪卵母细胞体外发育。     

江苏：首例徒手克隆猪诞生

一胎8头体细胞克隆小猪近日在南京农业大学诞生,这是江苏省首例利用徒手克隆核移植技术生产的克隆猪。     

供核细胞及处理方式对绵羊核移植效率的影响

旨在研究羔羊、胎儿成纤维细胞、绵羊类胚胎干细胞及处理方式对核移植效率的影响。比较了羔羊皮肤成纤维细胞饥饿及消化后平衡时间对细胞可用率的影响;胎儿成纤维细胞饥饿及消化后平衡时间对细胞可用率的影响;羔羊成纤维细胞、胎儿成纤维细胞、类胚胎干细胞在可用率及对融合率的差异和类胚胎干细胞与转基因羔羊皮肤成纤维细胞对核移植效率的影响。结果表明,饥饿对胎儿成纤维细胞可用率影响不大(P>0.05),但平衡时间影响极大(P<0.01);饥饿及平衡时间对胎儿成纤维细胞影响都很显著(P<0.01);胎儿成纤维细胞的可用率极显著高于类胚胎干细胞和羔羊皮肤成纤维细胞(P<0.01),融合率显著高于羔羊(P<0.05),但与类胚胎干细胞间没有差异(P>0.05);胚胎移植后,类胚胎干细胞的怀孕率显著高于羔羊皮肤成纤维细胞(P<0.05)。饥饿和平衡时间对供核细胞的可用率有显著影响,类胚胎干细胞的核移植效果好于成纤维细胞。