新城疫病毒广西分离株M基因的克隆与序列分析

根据基因库中新城疫病毒M基因核苷酸序列,设计一对特异性引物,对2000年-2003年期间广西分离的11个NDV毒株的M基因进行RT-PCR扩增、克隆和序列测定.结果表明,11个NDV广西分离株的M基因都为1 223个核苷酸,含有1个1 095 bp核苷酸阅读框(ORF),编码364个氨基酸.序列分析结果表明,这11个NDV分离株核苷酸的同源性在86%～99.9%之间,推导氨基酸的同源性在89.3%～99.7%之间;11个毒株与国内外其他7个NDV毒株比较核苷酸的同源性在83.3%～98.5%之间,推导氨基酸的同源性在87.4%～98.6%之间.     

基于石墨烯电化学免疫传感器检测牛病毒性腹泻病毒

构建一种新型电化学免疫传感器用于检测牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV),为BVDV提供一种新型快速的检测方法。利用甲壳胺(Chi)修饰石墨烯(G)并负载金纳米粒子(AuNP),得到石墨烯-甲壳胺-金纳米粒子(G-Chi-AuNP)纳米复合物用于修饰金电极,然后固定抗BVDV NS3蛋白单克隆抗体,构建BVDV电化学免疫传感器。所构建的电化学免疫传感器对BVDV的检测敏感度为10~(1.2) TCID_(50),特异性试验结果表明,该方法对牛轮状病毒(BRV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛分支杆菌(MB)、牛冠状病毒(BCV)和猪瘟病毒(CSFV)无交叉反应。研究建立的BVDV电化学免疫传感器具有特异性好和灵敏度高的优点,在BVDV快速检测领域具有良好的应用前景。     

牛病毒性腹泻病毒E2结构蛋白的原核表达、纯化及鉴定

根据GenBank中已发表的牛病毒性腹泻病毒囊膜糖蛋白E2基因设计1对特异性引物,以Oregon CV24株为模板,PCR扩增目的片断后与pET-32a原核表达载体连接,转化大肠杆菌Transetta（DE3）感受态细胞,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表达产物,结果表明重组E2蛋白在体外得到较好表达,表达的融合蛋白分子量为57.7 ku。可溶性分析表明重组E2蛋白以包涵体的形式存在,经镍柱His标签蛋白纯化后进行western-blot检测。结果表明：E2重组蛋白均具有反应原性,能与BVDV的阳性血清进行反应。     

二温式PCR检测罗非鱼嗜水气单胞菌的研究

根据基因库嗜水气单胞菌的脂肪酶基因序列设计1对特异性引物,用二温式PCR对从病死罗非鱼体内分离的8株嗜水气单胞菌进行扩增。特异性结果显示该引物对8株嗜水气单胞菌均能扩增出与预期大小相一致的760bp扩增产物,而对弧菌、肠炎杆菌、禽多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌的扩增均无任何条带。二温式PCR敏感性结果表明可以检测到10pg的嗜水气单胞菌DNA模板。     

牛分枝杆菌CFP-10基因的表达和重组蛋白的纯化

根据GenBank中牛分枝杆菌的基因序列,设计合成一对扩增CFP-10基因完整ORF的特异性引物,以pET32a（＋）为载体构建重组表达载体CFP-10／pET32a（＋）。重组表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3）,经0．9mmol／LIPTG37。C诱导3h后表达,收集菌体并裂解,裂解后上清和沉淀经SDS—PAGE分析,结果表明融合蛋白分子量分别为30kD,表达产物以可溶性存在于上清中,后经Ni．NTA吸附柱方法对目的蛋白进行纯化,经薄层凝胶扫描分析,纯化后的His融合蛋白纯度达95％,该CFP-10表达蛋白可作为体外诊断抗原,为进一步建立检测牛分枝杆菌的方法奠定基础。     

应用反转录—聚合酶链反应检测鸽Ⅰ型副粘病毒的研究

根据鸡新城疫病毒（ＮＤＶ）和鸽副粘病毒Ｆ基因的保守序列，设计合成１对引物ＸＺ９、ＸＺ１０，用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）对３种株鸽Ⅰ型副粘病毒均扩增出与预期大小相符的ＲＴ－ＰＣＲ产物，而对鸡传染性支气管炎病毒、禽传染性喉气管炎病毒、大肠埃希氏菌、禽腺病毒、禽巴氏杆菌扩增结果均为阴性；ＲＴ－ＰＣＲ最低能检出１ｐｇ的鸽Ⅰ型副粘病毒的核酸模板。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌apxIA基因在毕赤酵母中的表达与分析

构建猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)apxIA基因的真核表达载体pPICZαA/apxI,并在毕赤酵母GS115中进行表达。SDS-PAGE显示仅在浓缩40倍的上清中检测得到表达产物,同时经RT-PCR可检测到重组酵母中编码目的基因成熟肽的mRNA,经分析发现目的序列AT含量高达62%,其中含49个毕赤酵母稀有密码子,占15.4%。证实ApxIA在毕赤酵母中为低水平表达。     

H5和H7亚型禽流感病毒多重反转录聚合酶链反应快速检测及鉴别方法的建立

参考禽流感病毒(AIV)M基因和HA基因序列设计了3对引物，其中1对为针对不同HA亚型AIV的通用引物，另外2对为分别针对AIVH5和H7亚型的特异性引物。这些引物所扩增的cDNA片段大小分别为244、860和634bp。利用这3对引物，通过对多重RT—PCR扩增条件的优化，成功建立了快速检测鉴别AIVH5、H7亚型的多重RT—PCR技术。特异性和敏感性试验结果表明，该技术对AIV H5亚型同时扩增出2条大小分别为244bp和860bp的cDNA片段；对AIV H7亚型同时扩增出2条大小分别为244bp和634bp的cDNA片段；对AIV H5和H7亚型混合样品能同时扩增出3条大小分别为244、860和634bp的cDNA片段；对其他AIV HA亚型只扩增出1条244bp的cDNA片段；对其他常见禽病病原扩增均为阴性；该多重RT-PCR对AIV RNA、AIV H5和AIV H7亚型RNA的最低检出量分别为10、100和100Pg。     

10株新城疫病毒广西分离株HN蛋白基因的克隆与序列分析

根据基因库(GenBank)新城疫病毒(NDV)的HN基因序列设计了2对特异性引物,应用RT-PCR技术对广西在2000~2003年暴发新城疫的鸡群中分离的10株NDV毒株的HN基因进行了扩增,扩增产物克隆并测序,拼接出10个NDV广西分离株的HN基因全序列,其序列全长均为1 713 bp,编码571个氨基酸,均有13个半胱氨酸残基。其中GX8/03有6个糖基化位点,而GX2/00、GX6/02、GX7/02和GX5/00有5个糖基化位点,GX1/00、GX3/00、GX4/00和GX9/03有4个糖基化位点。除GX5/00和GX10/03分离株外,其他8个NDV分离株在HN基因抗原位点Ⅰ发生变异,即347位由谷氨酸(E)被甘氨酸(G)替代,GX8/03分离株在HN基因抗原位点Ⅱ的495位由赖氨酸(K)替代谷氨酸(E)。与11株已发表的NDV HN基因全序列相比较,其核苷酸同源性在79.6%~97.9%之间,推导的氨基酸同源性在87.2%~98.1%之间。     

真核表达质粒pTracer-CMV2FIL2在鸡体组织中表达及分布规律

将3周龄的三黄鸡肌肉接种200 μg真核表达质粒pTraeer-CMV2FIL2,巢式PCR法检测血清、心、脾脏、肺脏、法氏囊、脑、骨髓、胸腺和肌肉接种部位中pTracer-CMV2FIL2出现和存留的时间;荧光定量PCR法检测其在血液中的动态变化;RT-巢式PCR法检测其在上述部位的表达情况.结果显示,接种后2～3 h血清中可检测到pTracer-CMV2FIL2,6 h时在血液中的含量最高,7 d时已经检测不到;4 h后在上述器官中可陆续检测到pTracer-CMV2FIL2的出现,13 d后陆续消失;1 d后可陆续检测到质粒所转录的mRNA,13 d后陆续消失;接种后2 h可在接种部位肌肉的细胞中检测到pTracer-cMV2FIL2的出现,10 h可检测到mRNA,150 d时仍然可以在肌肉接种部位的细胞中检测到质粒和mRNA存在.