实时荧光定量PCR技术在检测外源基因拷贝数中的应用

通过对PCR法、Southern Blot法、IPCR法与实时荧光定量法4种转基因外源基因检测方法的比较认为:PCR扩增虽十分灵敏,但有时会出现假阳性扩增,因而对外源基因是否整合还需进行验证.Southren方法准确性高,特异性强,但存在费时、费力的缺点.同时实际操作中就需要较大量的植物材料来提取DNA,而转基因植物的愈伤组织在无菌条件下经过筛选、重新分化后,一般都比较细弱,不宜大量取样.IPCR法虽可以转座突变分离基因,但当转座子作为外源基因通过农杆菌介导等方法导入植物时,由于T DNA整合到染色体中引起插入突变并分离基因造成误差.实时定量PCR技术的特异性和高信噪比为转基因拷贝数定量提供了方便,实时定量PCR法,花费试剂少、节省劳力和时间,需要DNA样品量少、并不进行放射检测.同时对实时荧光定量PCR法计算进行了详细介绍.     

瓦维洛夫山羊草(Ae variloviichem)细胞质对普通小麦的遗传效应

将瓦维洛夫山羊草(Ae.variloviichem)细胞质导入普通小麦,研究其对普通小麦主要农艺性状的遗传效应.结果表明瓦维洛夫山羊草细胞质对普通小麦开花习性、小麦的品质、白粉病抗性均表现有利效应;显著降低普通小麦育性;其它主要农艺性状存在明显的不良效应.     

小麦铭贤169休眠解除期间种子结构与主要成分的变化

为探究小麦种子休眠解除期间的成分变化对发芽率的影响,了解种子休眠解除机制,以铭贤169为材料,在收获后不同储藏时间（间隔20 d）取样,通过显微设备观察了种子后熟期间的结构变化,测定了相关生理指标和成分,以探究铭贤169种子休眠性原因。结果表明,铭贤169种子休眠解除过程中,种皮细胞结构、组织结构、淀粉粒结构、蛋白基质等均发生变化,淀粉含量、粒径、糊化特性、热稳定性随贮藏时间延长变化显著。铭贤169的离体胚在花后25 d就具有发芽能力,但种子在花后35 d仍处于休眠。收获后熟期间,种胚活性、种子吸水率、含水量、淀粉含量、淀粉糊化谷值粘度和峰值时间、热稳定性逐步上升,与发芽率正相关。A型淀粉粒表面破损,淀粉粒与蛋白质结合紧密,种皮结构松散;淀粉粒径、淀粉酶活性、可溶性糖含量和沉降值减小;面筋和粗蛋白含量变化不大。推测铭贤169种子的休眠性与种子母体成分有关,休眠解除期间发芽率变化受种皮结构、淀粉的分解程度、淀粉粒与蛋白质的结合方式、可溶性糖含量、淀粉含量和性质以及淀粉酶活性等因素影响。     

小麦转基因技术的研究现状及在育种上的应用

近年来，利用植物转基因技术以提高作物产量，改善品质，增强抗病虫和抗逆能力，在生产上已卓见成效，小麦是重要的农作物，其转基因技术更是深受关注，概述了小麦转基因技术的研究现状，指出了其存在的主要问题，并对转基因技术在小麦育种中的应用作出展望。     

普通小麦籽粒性状的主基因+多基因遗传模型分析

为给小麦遗传育种中籽粒性状改良提供参考,以小麦大粒品系0911-46为母本与小粒品系42杂交产生P₁、P₂ 、F₁ 、BC₁ 、BC₂ 和F₂共4个世代6个群体,应用主基因+多基因混合遗传模型多世代联合分析方法分析了小麦粒重、粒长、粒宽、粒厚的遗传特点。结果表明,千粒重、粒宽、粒厚都符合2对加性-显性-上位性主基因+加性-显性-上位性多基因遗传模型。2对粒重主基因都具有正向加性效应,可以增加粒重,但其互作效应有正有负且互相抵消,对粒重影响不大。粒宽和粒厚的显性效应为正向作用,有利于增加籽粒体积。粒长符合加性-显性-上位性多基因模型,无主基因。千粒重主基因+多基因遗传率在BC₁、BC₂、F₂三个分离世代分别为88.02%、78.53%、87.82%;粒长多基因遗传率在3个分离世代分别为71.95%、61.64%、62.93%;粒宽主基因+多基因遗传率在3个分离世代分别为43.90%、32.69%和68.47%;粒厚主基因+多基因遗传率在3个世代分别为50.01%、42.86%和68.63%。所有籽粒性状中以粒重的遗传力最高。     

小麦再生相关基因TaDCC1-2B的克隆与功能验证

硫氧还蛋白DCC1在拟南芥中依赖氧化还原修饰通过调节活性氧(ROS)的稳态来调控植物的再生。为深入了解小麦中该基因的序列特征及功能,从普通小麦‘中国春’中克隆获得一个小麦硫氧还蛋白基因 TaDCC1-2B,其CDS长度为645 bp,编码214个氨基酸。生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白分子质量为23.59 ku,理论等电点为8.94,亲水性总平均值为-0.409,推测为亲水性蛋白。系统进化分析表明该基因在不同物种间具有较强的保守性,启动子区域含有与分生组织形成和赤霉素响应相关的的顺式作用元件。利用农杆菌介导法将 TaDCC1-2B基因转入拟南芥硫氧还蛋白突变体dcc1中,转基因植株根尖诱导的再生芽的再生率接近于野生型,其体内 TaDCC1-2B和WUS基因的表达水平也显著高于突变体,表明转基因株系中 TaDCC1-2B基因的过量表达维持了愈伤组织中内源ROS水平的稳定,使得WUS基因得以正常表达,从而维持了拟南芥愈伤组织的再生能力,推测 TaDCC1-2B基因可能在小麦组织培养过程中也将发挥相似作用。     

农杆菌浸根对小麦苗期生理生化特性的影响

采用再裂区设计,以小麦基因型西农979、西农889、郑麦9023为主区,浸根所用小麦根长4、7、10cm为副区,农杆菌浓度0、0.5、1.0、1.5OD为副副区,对农杆菌浸根后小麦幼苗生理生化特性进行测定。结果表明,西农889的根系生长速率、根系活力、POD活性以及SOD活性均高于郑麦9023与西农979;随浸根根长的增加,根系生长速率、幼苗根质量、根系活力、POD活性均增加,MDA质量摩尔浓度在根长为4～7cm时增加,7～10cm时变化不明显,而苗高随根长的增加,呈下降趋势;与CK相比,农杆菌浓度为0.5OD时,小麦根系生长速率、幼苗根质量以及根系活力略有升高,随着农杆菌浓度的增加,则均明显下降,MDA质量摩尔浓度一直呈上升趋势,POD活性与SOD活性呈先升后降趋势。综合农杆菌浸根处理对小麦苗期主要生理生化特性的影响,农杆菌浸根较适宜的菌液浓度为0.5OD,根长为10cm,较适宜转化的基因型为西农889。     

小麦种子萌发基因TaJAZ1的克隆和功能研究

小麦品种铭贤169是我国黄淮麦区育种研究广泛应用的条锈病诱发材料,但其种子休眠时间过长,不仅影响播种后均匀发芽和生长发育,其收获掉落籽粒也容易导致秋季育种田的生物学混杂。本研究通过筛选其休眠种子与萌发种子的转录组学数据,克隆获得差异表达基因TaJAZ1,并对其生物信息学特性、亚细胞定位、表达模式进行分析,结合解析拟南芥jaz3（与TaJAZ1同源性最高）突变体、TaJAZ1过表达拟南芥和水稻的表型反应。结果表明,TaJAZ1基因编码区全长1 230 bp,可编码409个氨基酸,在不同物种间保守性较强,与野生二粒小麦JAZ1基因的亲缘关系最近;启动子区含有脱落酸响应元件ABRE 和茉莉酸甲酯响应元件CGTCA-motif和TGACG-motif;该基因定位于细胞核和细胞膜,TaJAZ1基因在种子发育中穗发芽时期表达量达到最高,进入成熟时期表达量显著降低;ABA能诱导TaJAZ1基因的表达,ABA处理下过表达拟南芥的萌发率比野生型和jaz3突变体高,ABA信号通路基因AtABI5的诱导量变低;TaJAZ1过表达水稻的萌发率高于受体水稻, ABA处理后,OsABI5的诱导量也降低。以上结果证明,TaJAZ1基因能促进种子萌发,进一步验证其在ABA信号通路中起负调控作用,为改良铭贤169等强休眠性小麦品种提供参考。     

小麦TaSPL17基因的克隆、组织特异性表达及原核表达分析

具有SBP结构域的SPL(SQUAMOSA promoter-binding protein-like)蛋白是一类植物特有的转录因子,在植物的生长发育过程中发挥重要的调控作用。为了进一步研究小麦基因TaSPL17的功能,本研究通过同源克隆的方法,从普通小麦品种‘小偃22’中克隆得到TaSPL17基因全长CDS序列。生物信息学分析表明,该基因开放阅读框长度1 158bp,编码385个氨基酸,理论分子质量40.25ku,理论等电点为9.12。半定量RT-PCR结果显示,TaSPL17在小麦根、茎基部、叶片、幼穗中均有表达,在幼穗和茎基部中表达量最高,根次之,在叶片中表达量最少,表明TaSPL17基因可能与小麦的分蘖和穗部的发育有关。将基因TaSPL17与载体pGEX6P-1连接构建原核重组表达载体pGEX6P-1-TaSPL17,然后将其转入大肠杆菌DH5α并对诱导表达的时间、IPTG浓度、温度进行优化,SDS-PAGE分析表明,融合GST标签的TaSPL17在温度37℃,IPTG浓度为0.4mmol/L,诱导3h后表达量最大,有助于进一步纯化TaSPL17蛋白质。     

转PSAG12-IPT基因小麦安全性的初步研究

对转PSAG12 IPT基因小麦植株根际土壤及其周边小麦、大麦、燕麦进行了基因漂移检测,并对食用转PSAG12 IPT基因小麦混合饲料的小白鼠进行了毒理性试验,初步研究了转PSAG12 IPT基因小麦的安全性。结果表明,PSAG12 IPT基因并未通过根系分泌物漂移到土壤中;除西农1376在距离T2代西农1376小麦3和6m处各发现1株PCR阳性植株外,在小麦郑9023及大麦和燕麦中均未发现PSAG12 IPT基因存在;食用含有转基因小麦混合饲料的小白鼠和对照小白鼠的肝脏和肾脏的结构解剖图未见明显差异,可以初步认为应用转PSAG12 IPT基因小麦是较安全的。