VFB抗烟草花叶病毒活性及对烟草叶片超微结构的影响

【目的】评价植物源病毒抑制剂VFB的抗烟草花叶病毒(TMV)活性,并初步探讨其作用机理。【方法】以心叶烟(Nicotiana glutinosaL.)和普通烟(Nicotiana TabacumL.)为寄主材料,采用半叶枯斑法测定了VFB对烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)的体外钝化作用及对TMV初侵染和增殖的抑制作用,并用透射电镜技术研究了VFB对感染TMV烟草叶片超微结构的影响。【结果】VFB对TMV具有明显的体外钝化作用,在对TMV钝化0.5,1和2 h后,其抑制率分别为44.41%,55.62%和64.43%;VFB对TMV侵染心叶烟具有较好的预防作用,其50倍稀释液在24和48 h的抑制率分别达到54.33%和55.60%,均优于对照药剂病毒A;VFB对TMV有一定的治疗作用,其50倍稀释液的抑制率为36.15%,略低于对照药剂病毒A。烟草叶片病理结构的超微观察表明,普通烟感染TMV后,叶片中大部分细胞结构会受到不同程度的破坏,经VFB处理的烟草,花叶症状减轻,叶片中的TMV粒子显著减少,叶绿体和线粒体的解体症状减轻,并产生大量嗜锇颗粒和膜体。【结论】VFB对TMV具有较好的抑制作用。     

胆碱对高脂胁迫的团头鲂肝脏抗氧化、组织结构和免疫力的影响

以初始体质量(42.20±0.34)g团头鲂为研究对象,研究饲料中添加胆碱对高脂胁迫团头鲂肝脏抗氧化、组织结构和免疫力的影响。实验采用2×2因子设计方法,共配置2个脂肪水平(5%和15%)和2个胆碱水平(1200和2200 mg/kg)的等氮饲料4组。养殖实验在室内循环水系统中进行,养殖周期为8周。养殖实验结束后进行血液和肝脏生化指标、肝脏抗氧化指标和非特异性免疫指标等的检测分析,以及观察肝细胞的超微结构变化。结果显示,当饲料中添加1200 mg/kg胆碱时,随着脂肪水平的升高,团头鲂肝脏脂肪含量和甘油三酯浓度显著增加,而血浆中谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)活性则显著上升;肝脏中丙二醛(MDA)含量、总超氧化物歧化酶(t-SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性等显著升高;血液中白细胞数、溶菌酶活性、总蛋白和球蛋白水平以及还原型谷胱甘肽(GSH)活性显著降低;超微结构观察到肝细胞中存在大量脂滴,伴随着细胞核变性、核膜残缺、线粒体水肿等异常现象。这些结果表明高脂日粮不仅导致肝细胞的结构和功能的损伤,而且造成肝脏氧化应激和机体免疫力的下降。在高脂饲料(15%脂肪)中添加2200 mg/kg胆碱,可显著降低肝脏脂肪含量、血浆谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)活性,显著降低肝脏丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性,并显著提高白细胞数和球蛋白水平以及还原型谷胱甘肽(GSH)活性,同时肝细胞形态及细胞器结构也趋于正常。研究表明,添加适量胆碱能够减少肝脏脂肪沉积,维持肝脏结构和功能的正常,并增强团头鲂抗氧化能力和机体免疫力,继而保持鱼体的健康。     

半滑舌鳎创伤弧菌分离鉴定及其荧光定量PCR方法的建立

为确定患病半滑舌鳎的病原,从其体内分离到3株革兰氏阴性菌,将其分别命名为ST-1、ST-3和ST-6,进行细菌理化特性、药敏试验、16S rDNA测序以及组织病理学观察等方面的研究,并建立了外膜蛋白(OMP)基因的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。结果显示,3株分离菌株的理化特性符合创伤弧菌特征,16S rDNA与创伤弧菌标准菌株ATCC29307序列相似性达99%以上,系统发育树分析显示,3株分离株与创伤弧菌自然聚为一支,最终鉴定为创伤弧菌;药敏试验显示,3株菌对头孢克肟、头孢哌酮、链霉素、亚胺培南和氟苯尼考等药物高度敏感。人工回归感染试验表明,分离株具有致病性,且半滑舌鳎、斑马鱼的临床症状与自然患病鱼症状相似;组织病理学观察显示,鳃丝上皮细胞增生,鳃小片肿胀黏连、颗粒细胞和黏液细胞增多,肝脏中央静脉淤血,肾脏出血、坏死,肠道黏膜固有层萎缩、黏液细胞增多等。进一步建立OMP基因的荧光定量PCR方法,结果显示,标准曲线的相关系数为0.995,检测下限为1.88×10~2 CFU/mL。以上结果可为半滑舌鳎弧菌病的致病机理、分子诊断和防治提供科学参考。     

蟾蜍似矛球吻棘头虫的临床病例研究

【目的】 对1例中华蟾蜍多脏器寄生虫感染临床案例进行病理诊断并通过分子生物学鉴定其物种分类。【方法】 对实验室饲养的1只消瘦、拒食后发生死亡的雌性中华蟾蜍进行解剖观察，病理组织学研究，采用蠕虫剖检法、结节压片法对分离获得的虫体进行形态学观察研究，并进行分子生物学鉴定。【结果】 剖检发现蟾蜍心脏、肝脏等脏器及多系膜寄生棘头虫，未在蟾蜍体内发现线虫、吸虫等其他蠕虫寄生。HE染色结果显示，棘头虫的感染寄生造成了蟾蜍肺脏、肝脏等多脏器的机械性损伤、炎性反应，其中肠壁黏膜发生严重损坏脱落。通过PCR扩增其细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ（cytochrome c oxidase subunit Ⅰ，COⅠ）基因片段，获得5株不同部位的目的虫株COⅠ基因目的片段，经对比发现，鉴定的棘头虫均为同一种棘头虫，且其GC含量在40.14%~40.83%之间。选取JS-01株进行NCBI-BLAST比对，与似矛球吻棘头虫（Sphaerirostris lanceoide，登录号：MG931943.1）相似性最高，为99.5%。借助分子生物学分析并结合形态学观察结果确定其为似矛球吻棘头虫。【结论】 似矛球吻棘头虫的大量感染寄生造成了蟾蜍的死亡，本试验结果可为药用蟾蜍棘头虫病的防控提供临床症状、病理、分子生物学等方面的参考，对两栖动物似矛球吻棘头虫的诊断与研究具有参考价值。     

脊尾白虾“僵尸病”的初探

为确定2018年冬季以来江苏省沿海地区养殖脊尾白虾患“僵尸病”的病原及流行病学特点，实验采用LB培养基和PDA培养基从病虾血淋巴中分离得到直径为1~3 mm、边缘整齐、米黄色隆起菌落；人工回感实验结果显示，回感后的脊尾白虾表现出与自然患病脊尾白虾相同的症状，并在回感脊尾白虾体内也分离出了相同的菌株，符合科赫氏法则。对该菌株进行形态观察结合18S rRNA序列对比及系统发育分析，发现分离菌株MQ2101具有酵母的典型形态，且与二尖梅奇酵母相似度达99.82%，结果表明菌株MQ2101为二尖梅奇酵母。致病性结果初步分析显示，MQ2101对脊尾白虾的半致死浓度 (LD₅₀)为1.39×10⁷ CFU/尾。病理学观察发现，患病脊尾白虾鳃、肌肉和肝胰腺均发生不同程度的病变，其中肝胰腺病变最为严重，肝小管呈现空泡化，管腔体积变大；在鳃和肝胰腺组织中均存在大量定殖的菌体。流行病学调查结果显示，每年2—5月发病迅速，发病率为5%~30%，死亡率为3%~10%。本研究确定了二尖梅奇酵母为江苏沿海地区脊尾白虾“僵尸病”的病原，其对脊尾白虾具有较强致病性，主要侵染组织为肝胰腺和鳃。以上研究结果为脊尾白虾“僵尸病”的防控提供了相关科学依据。     

大口黑鲈蛙病毒分子流行病学及组织病理分析

为探讨大口黑鲈蛙病毒（LMBV）的分子流行规律及在感染后的组织病理变化，实验对2019—2021年采集的723份患病大口黑鲈样品进行荧光定量PCR （qPCR）检测。结果显示，LMBV的阳性率为63.62%，挑选阳性样品接种鳜脑细胞（Chinese perch brain cells,CPB），共获得93株LMBV。通过对分离株MCP、ATP酶、DNA聚合酶和甲基转移酶基因进行PCR扩增与测序分析，发现上述基因在LMBV分离株中均保守，其中MCP、ATP酶基因一致性均为100.0%、甲基转移酶基因一致性为99.7%～100.0%、DNA聚合酶基因一致性为99.8%～100.0%。选取1株LMBV毒株感染健康大口黑鲈，采用qPCR方法对不同组织中的病毒载量进行检测，结果显示，大口黑鲈蛙病毒在心脏、肝脏、脾脏、肾脏、胃、肠和脑等组织中均有分布，人工感染LMBV后的前5天病毒载量逐步升高；感染后第5天，心脏中病毒载量最高（9.5×10⁵个/mg拷贝），脑组织中病毒载量最低（2.9×10²个/mg拷贝）。组织病理结果表明，LMBV可导致大口黑鲈多种组...     

养殖大菱鲆中牙鲆肠弧菌的分离鉴定及组织病理学

2007年1月，山东省胶南某养殖场人工养殖的大菱鲆（Scophthalmus maximus）发生严重病害并大批死亡。病鱼的主要症状是体表溃疡，腹腔积液，肠道肿胀，肝脏萎缩，胆囊暗绿色等。从病鱼胆囊中分离纯化得到优势菌株，命名为da3。人工感染试验证实，该菌株对大菱鲆有较强的致病性。对体重为25 g的大菱鲆的半数致死量为每尾鱼2×106 cfu。通过细菌16S rDNA序列测定及形态学和生理生化特征研究确定，该病原菌为牙鲆肠弧菌（Vibrio ichthyoenteri）。组织病理学观察表明，病鱼的肝脏、肾脏、脾脏、肠道和脑的微观结构发生了明显的病理变化，由此引起的器官功能衰竭可能是病鱼死亡的主要原因。本文结果对大菱鲆细菌性病害的控制具有参考价值。     

鳢流行性溃疡综合征病原分离鉴定与病理形态学观察

为寻找冬春季鳢(Channa maculata)烂身病的病原,应用组织压片、组织切片、扫描电镜技术、HE常规染色法和Grocott六胺银染色法、霉菌分离纯化及ITS的序列分析等对冬春季患疑似溃疡综合征的烂身病鳢进行了病原学与病理学研究。病变组织压片观察到大量直径10～20μm,分枝较少、纤细菌丝。扫描电镜观察到肌肉组织中延伸出大量的纤细的丝状真菌。患病鳢皮肤和肌肉表现为变性、坏死与炎性细胞浸润,溃疡灶肌肉内可见大量的慢性肉芽肿结节和炎性细胞浸润。结节基本结构由类上皮细胞和多核巨细胞、炎性细胞、霉菌菌丝(横断面呈圆形,斜断或纵断呈丝状)组成,霉菌位于结节中央。Grocott六胺银染色观察到结节中有大量棕色菌体。无菌分离培养可观察到典型丝状霉菌;霉菌在灭菌池塘水20℃过夜, 12 h后可观察原代孢子群形成,真菌ITS序列分析表明其与侵袭丝囊菌(Aphanomyces invadans)同源性为100%。侵袭丝囊霉菌(A. invadans)是杂交鳢溃疡综合症病的主要病原,为鱼类流行病学调查和疾病防治的深入研究奠定基础。     

养殖大黄鱼一种黏孢子虫病的组织病理学及检测方法初探

运用组织病理切片、电镜观察及PCR扩增等方法对2017年在舟山采集到的临床表现"白鳃"症状的发病大黄鱼(Larimichthyscrocea)开展了病原学及快速检测方法的初步研究。组织病理观察显示,患病鱼的肝、脾、肾等内脏组织发生严重的病理变化,尤其是组织内红细胞发生明显的退行性变化,同时血液中红细胞数量显著减少。在病鱼组织的电镜超薄切片中可观察到直径约300～600 nm的孢子虫样结构。提取病鱼内脏组织总基因组DNA样本,采用1对针对寄生原虫的通用引物进行SSUrDNA的PCR扩增,最终获得大小为1471bp的特异性条带,经测序比对发现,该条带与GenBank中1种黏孢子虫Sinuolinea sp.的序列同源性最高,达89%。根据获得的SSU rDNA序列,建立了适用于该病临床检测的巢式PCR方法,最小灵敏度可达0.5 pg。研究表明,引起此次网箱养殖大黄鱼"白鳃"症状并导致鱼类大量死亡的是一类寄生性黏孢子虫。     

寄生于两种湖泊淡水鱼的伊格诺图斯胃瘤线虫IV期幼虫PCR分析、形态结构和组织病理

为探明寄生于翘嘴鲌（Culter alburnus Basilewsky）和花（鱼骨）（Hemibarbus maculatus Bleeker）腹腔内线虫的分类地位、形态特征及其寄生部位的组织损伤作用，进行了18S rDNA和ITS rDNA序列的PCR分析以及虫体和组织病理的显微观察。结果表明该线虫为伊格诺图斯胃瘤线虫（Eustrongylides ignotus）的IV期幼虫，明确了其ITS rDNA的基因序列。虫体除头部具有6个棘状突起和6个乳头状突起以及尾部具有尾斑突外，还发现其具有凹纹的体侧斑突等一些新的形态结构特征，补充了一些主要形态结构数据。根据体肌肌细胞数量和其一端伸入体腔的特点判定线虫体肌属于多肌型。食道由背侧腺和下腹腺组成，食道腔横切面呈三放射形。依据组成肠道的单层柱状上皮细胞数量，判定该线虫肠道属于多胞型。卵巢、输卵管、精巢和输精管外层均由以纤维细胞为主要成分的结缔组织构成。病理观察显示部分线虫以包囊形式寄生于肝脏、肠系膜和脾脏的腹腔组织器官，形成由纤维细胞和血管组成的包囊和大量嗜酸性白细胞浸润的主要炎症反应，包囊经历了形成、增大、壁增厚和后期包囊壁中细胞坏死而破裂的过程，严重感染的个体出现肝脏充血、细胞坏死和含铁血黄素沉着，脾脏缺血和含铁血黄素沉着以及肠系膜中的胰腺细胞分泌颗粒增多等病理变化。结果表明，该IV期幼虫对寄主内脏组织器官具有不同程度的组织病理损伤作用。