应用双抗夹心ELISA法检测皱纹盘鲍致病病原—创伤弧菌的研究

以皱纹盘鲍脓足病致病病原－ － 创伤弧菌为抗原,制备兔抗血清,抗体纯化后以辣根过氧化物酶标记,建立检测创伤弧菌的双抗夹心ＥＬＩＳＡ 检测法。结果表明,双抗夹心ＥＬＩＳＡ 法有较高的灵敏度,可检出含菌１０４ 个／ｍｌ 的菌悬液。与创伤弧菌对照菌株有明显的阳性反应不与副溶血弧菌、溶藻胶弧菌、河流弧菌等８ 株对照菌株产生影响检测结果的交叉反应。应用该法检测３０ 份病鲍样品,阳性检出率为６６ ．７ ％ 。     

杂色蛤病原菌—溶藻弧菌的分离与回接感染试验

1991年7月下旬至10月上旬,辽宁东沟县沿海出现杂色蛤大批死亡,从病杂色蛤体内分离到病原菌,经人工感染试验得到证实。病原菌为革兰氏阴性短杆菌,以极生单鞭毛运动,在TCBS琼脂平板上形成黄色大菌落,在固体培养基上能游动。发酵葡萄糖产酸不产气,精氨酸—碱反应阴性,赖氨酸、鸟氨酸脱羧阳性,对弧菌抑制剂0/129(150μg)敏感,被鉴定为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)。通过回接试验证明此溶藻弧菌使杂色蛤死亡。     

轮虫中的氮向鲢,鳙鱼苗体内迁移规律的初步研究

稳定性同位素＾１５Ｎ示踪研究表明，在实验室条件下，轮虫体内氮向鲢，鳙鱼苗体内的迁移速率随温度升高而增大，且向鲢苗的速率高于鳙苗，人工光照时，轮虫体氮向两种鱼苗的迁移率连续上升，无昼夜变化，并且向鲢苗的速率亦高于鳙苗；水温２１℃时，鲢，鳙鱼苗对轮虫氮的利用率分别为８２．２３％和８２．９８％，无显著差异。     

半滑舌鳎创伤弧菌分离鉴定及其荧光定量PCR方法的建立

为确定患病半滑舌鳎的病原,从其体内分离到3株革兰氏阴性菌,将其分别命名为ST-1、ST-3和ST-6,进行细菌理化特性、药敏试验、16S rDNA测序以及组织病理学观察等方面的研究,并建立了外膜蛋白(OMP)基因的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。结果显示,3株分离菌株的理化特性符合创伤弧菌特征,16S rDNA与创伤弧菌标准菌株ATCC29307序列相似性达99%以上,系统发育树分析显示,3株分离株与创伤弧菌自然聚为一支,最终鉴定为创伤弧菌;药敏试验显示,3株菌对头孢克肟、头孢哌酮、链霉素、亚胺培南和氟苯尼考等药物高度敏感。人工回归感染试验表明,分离株具有致病性,且半滑舌鳎、斑马鱼的临床症状与自然患病鱼症状相似;组织病理学观察显示,鳃丝上皮细胞增生,鳃小片肿胀黏连、颗粒细胞和黏液细胞增多,肝脏中央静脉淤血,肾脏出血、坏死,肠道黏膜固有层萎缩、黏液细胞增多等。进一步建立OMP基因的荧光定量PCR方法,结果显示,标准曲线的相关系数为0.995,检测下限为1.88×10~2 CFU/mL。以上结果可为半滑舌鳎弧菌病的致病机理、分子诊断和防治提供科学参考。     

鳗弧菌L-18株的限铁条件和铁调节外膜蛋白的免疫效果研究

利用Western-blot技术,对鳗弧菌L-18株的OMPs和IROMPs的免疫反应性进行了分析,并通过免疫牙鲆比较二者免疫保护力的差异,以期从IROMPs方向探索开发鳗弧菌新型鱼用疫苗,并为研究其免疫原理提供重要的科学依据。结果表明,培养基中加入不同浓度的联铁剂,鳗弧菌L-18株的生长和铁载体的表达出现规律性变化,其中加入100~130μmol·L-1 2,2’-联吡啶为最适合限铁条件,此时铁载体的表达量最高且生长受抑制程度较小。在此条件下,菌株表达出74.3ku和77.4ku的IROMPs,其中77.4ku蛋白具有免疫反应性,为重要抗原。用全菌灭活疫苗、OMPs、IROMPs分别腹腔注射免疫牙鲆7周后攻毒, IROMPs疫苗的相对免疫保护力达到75.9%,远高于OMPs疫苗的51.8%。相对于OMPs,IROMPs的抗体效价显著提高,接近全菌疫苗组的水平,而血清杀菌活力没有显著变化。 关键词：鳗弧菌;铁调节外膜蛋白;牙鲆     

大菱鲆致病性溶藻弧菌SR1的外膜蛋白及其抗原性分析

用十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)抽提结合超速离心的方法提取了一株大菱鲆致病性溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)SR1和其他7株弧菌的外膜蛋白。通过SDS-PAGE图谱分析比较了这8株弧菌外膜蛋白的组成,结果表明,8株弧菌的外膜蛋白电泳一般可得到6-12条条带,其分子量多集中在65-106 kD和28-48 kD,其中36 kD的蛋白带为8株弧菌所共有。用兔抗SR1全菌血清进行Western-blot印迹显示,菌株SR1的外膜蛋白条带中有6条发生了阳性反应,其分子量分别为73 kD、48 kD4、5 kD3、9 kD、36 kD和32 kD。而其他7株弧菌的外膜蛋白与兔抗SR1血清也发生程度不等的阳性反应,这些阳性反应条带的分子量集中在65-73 kD、45-48 kD和36-41 kD之间,其中36 kD的外膜蛋白在8株弧菌中均出现明显的阳性反应,说明36 kD的外膜蛋白是这8株弧菌共有的特异性抗原。     

饲料中添加酵母提取物对凡纳滨对虾免疫相关基因表达及抗菌机能的影响

为了评估饲料中添加酵母提取物对凡纳滨对虾免疫灵敏性和平衡性的相关基因表达的影响,以鱼粉含量为24.5%的基础饲料(对照组)及在基础饲料中添加2.5%酵母提取物的实验饲料,分别饲喂凡纳滨对虾56 d,检测两种饲料投喂的对虾在急性感染溶藻弧菌前后鳃组织Toll受体、IM D和溶菌酶mRNA表达量变化及感染后的对虾死亡情况。结果表明:摄食添加酵母提取物饲料的凡纳滨对虾鳃组织中Toll受体mRNA和溶菌酶mRNA表达量均显著高于对照组对虾(P0.05),IMD mRNA表达量与对照组无显著性差异(P0.05)。急性感染溶藻弧菌后,两组对虾鳃组织Toll受体、IMD和溶菌酶mRNA表达量随感染进程均出现显著变化,Toll受体、IMD和溶菌酶mRNA表达量峰值出现的时间分别为24、42和36 h,且摄食添加酵母提取物组对虾各基因的表达量峰值分别为对照组峰值的201.06%、481.46%和276.77%,均显著高于对照组对虾(P0.05)。摄食添加酵母提取物饲料组对虾鳃组织中Toll受体和IM D mRNA表达量在感染溶藻弧菌后12和24 h分别出现显著上调,而对照组对虾鳃组织中Toll受体和IMD mRNA表达量分别在感染弧菌后24和42 h才出现显著上调。两组对虾经溶藻弧菌人工急性感染后72 h内的累积死亡率无显著差异(P0.05)。实验表明,饲料中添加酵母提取物上调了溶藻弧菌感染前凡纳滨对虾Toll受体和溶菌酶mRNA的表达量,提早了溶藻弧菌感染后对虾Toll受体和IMD mRNA表达量上调时间,且增加了对虾Toll受体、IM D和溶菌酶mRNA表达量的峰值,在一定程度上提高了凡纳滨对虾免疫相关基因表达的灵敏性。     

抗弧菌海洋细菌的分离筛选及其抗菌作用测定

采集连云港海域海水、海泥以及海洋动植物等样品86个,分离到海洋细菌176株.以病原性弧菌鳗弧菌为指示菌,采用平板对峙法在2216E培养基上测定不同海洋细菌菌株的抗菌作用, 其中XDY-7-4、YC-6-3、BM-1、BN-1、BN-2和XS1-5等6个海洋细菌菌株有明显的抗菌作用,菌株BN-1的抑菌带为11.2 mm,抗菌作用最强;其次为菌株XS1-5 、XDY-7-4 和YC-6-3,抑菌带宽度为10.4、10.2、9.9 mm;菌株BN-2和BM-1对鳗弧菌的抑菌作用较弱. 采用打孔法测定不同海洋细菌菌株无菌发酵液的抗菌作用,结果表明,菌株BN-1对鳗弧菌生长的抑制作用最明显,其次为菌株YC-6-3和XDY-7-4,菌株BM-1、XS1-5和BN-2的抗菌效果较弱.     

弧菌影响斑节对虾受精卵和无节幼体发育的研究

用8种弧菌对斑节对虾受精卵和无节幼体进行感染试验,结果表明,8种弧菌严重地影响虾卵的孵化和幼体的正常发育,其中以混合弧菌感染致病性最强。试验还显示了弧菌对越是早期的胚胎侵害力越强。     

光合细菌配合面包酵母与藻粉培养轮虫的实验

以面包酵母与一定量螺旋藻粉培养褶皱臂尾轮虫的过程中，添加光合细菌液进行实验。结果表明：光合细菌作为辅助性饵料，对轮虫的生长具有明显特殊的促进作用。4组实验显示：投喂适宜量光合细菌轮虫增殖明显加快，但与光合细菌添加量的增加不完全呈正比关系；投喂光合细菌新鲜培养液与老培养液轮虫增殖效果相近；投喂光合细菌只能作为辅助性饵料。当配合酵母、藻粉培育轮虫时，3者在饵料上起到了良好的互补作用，培养效果最佳。