水仙花叶病毒RT-PCR检测方法的建立及应用

旨在建立水仙花叶病毒(Narcissus mosaic virus,NMV)的分子快速检测方法。根据已公布的NMV基因序列,设计一对特异性引物,以提取的水仙样品总RNA为模板进行RT-PCR,并对该方法的特异性、灵敏度、重复性及实际检测效果进行测定。从感染NMV的水仙样品中成功扩增出预期大小（约483 kb）的特异性目的片段,而健康水仙上未扩增到相应的片段。特异性、灵敏度及重复性测定结果表明,本研究建立的RT-PCR方法特异性强、灵敏高、重复性好。应用该方法成功检测了一批口岸送检的水仙样品。本研究建立的RT-PCR方法可为水仙上NMV的检测提供可靠的技术支持。     

PVYNTN-NW榆林分离物的全基因组序列测定与分析

【目的】马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）是马铃薯病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属（Potyvirus）代表成员,是马铃薯和烟草生产中分布最为广泛并造成严重经济损失的病毒之一。研究旨在揭示PVY榆林分离物ShX14的全基因组特征,并准确判断其株系分子类型。【方法】根据已经报道的PVY不同基因保守区设计11对简并引物,采用片段重叠法从感染 PVY的马铃薯病叶中扩增、克隆获得榆林分离物ShX14的全长序列,并对其序列特征、重组位点、系统发育关系等进行分析。同时,应用系统发育与性状关联分析（phylogeny-trait association analysis）评估PVY分离物与株系的关联性。【结果】测序获得的ShX14分离物核苷酸序列全长为9 724 nt（不含3′端的多聚腺苷酸尾）。该病毒基因组含有一个9 186 nt的开放阅读框,编码3 061个氨基酸的多聚蛋白（polyprotein）。在P3顺反子中+2相位上也发现由移码（reading frame shift）产生的PIPO蛋白。全基因组序列比较分析显示,ShX14分离物与HN2、SYR-NB-16分离物（PVY^NTN-NW株系SYR-I型）的核苷酸、氨基酸序列的一致性分别为98%-99%和98%-100%。该分离物的P1、HC-Pro/P3和CP基因的5′端均检测到显著的重组信号,重组位点分别位于2 318、5 674 和8 385 nt,与PVY^NTN-NW株系（SYR-I型）的重组位点相似。系统发育分析结果显示该分离物与HN2、SYR-NB-16分离物相聚成簇,表明其在系统发育关系上,与PVY^NTN-NW株系（SYR-I 型）的亲缘关系最近。系统发育分析与性状关联分析结果显示该分离物与PVY^NTN-NW株系（SYR-I 型）的关联系数（association index, AI）、简约分值（parsimony score, PS）和最大单系分支（maximum monophyletic clade, MC）3个统计检验均显著,表明其与PVY^NTN-NW株系（SYR-I型）存在显著的关联性。同时,应用多重RT-PCR成功扩增出约为1 000、600和400 bp的3个特异性片段,与PVY^NTN-NW株系（SYR-I型）的特异条带大小相一致。这些结果也进一步确定该分离物属于 PVY^NTN-NW株系（SYR-I型）。【结论】ShX14 分离物为N×O重组分离物,属于PVY^NTN-NW株系（SYR-I型）,为后续深入开展该分离物的生物学等研究奠定了基础。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒的生物学与分子检测鉴定

根据已报道的黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)外壳蛋白(CP)基因序列合成1对引物,对侵染黄瓜的CGMMV广西分离物CP基因片段进行扩增和序列分析,结果表明该分离物与CGMMV-GX-G (DQ647384)同源性最高,达100％.将病毒分离物摩擦接种于5种葫芦科植物、普通烟、心叶烟及苋色藜上,结果表明在葫芦科植物上均...     

复合生物肥对芹菜生长及产量的影响

在使用常规肥料用量或减少常规肥料用量的基础上施用复合生物肥,研究复合生物肥对芹菜生物学性状及产量的影响。结果表明,施用复合生物肥对芹菜生长有一定的积极影响,与常规施肥相比,芹菜生育表现有明显提高,大田生长期缩短,茎叶性状改善,增产7.3%,经济效益提高6.6%。若将常规肥料用量减少30%,增产效果更为明显,经济效益更好,增产10.5%,提高经济效益10.3%。     

番红花种球中虎眼万年青花叶病毒的分子鉴定与序列分析

【目的】对一批荷兰进境番红花种球(Crocus sativus)进行病毒鉴定,以防止危险性病毒传入危害。【方法】根据已报道的马铃薯Y病毒科(Potyviridae)通用引物(Sprimer和M4T),采用RT-PCR方法对一批番红花种球样品进行检测,取其中一个RT-PCR产物进行克隆测序,利用Gen Bank上的基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool,BLAST)和MEGA 6中的基于对数期望的多重序列比较(Multiple Sequence Comparison by Log-Expectation,MUSCLE)进行序列比对分析,并根据外壳蛋白基因(coat protein,CP)序列利用最大似然法(maximum likelihood method)进行系统发育分析。【结果】RT-PCR检测结果显示该批样品扩增到一条约1.7 kb的预期大小片段,说明该批番红花种球样品中存在Potyviridae科病毒。测序获得长度为1 666bp的序列(命名为2677-NL),含有部分核内含体b基因(nuclear inclusion b,NIb)、完整的CP和3′端非编码区(3′-UTR),其核苷酸序列与虎眼万年青花叶病毒(Ornithogalum mosaic virus,Or MV)的SW3.3分离物具有最高序列一致性(99.6%),与Or MV参考基因组序列(Reference genomic sequences,Ref Seq;NC_019409)的序列一致性为99.1%。该分离物的CP与6个Or MV印度分离物(JQ686722、JQ686720、JN692498、JN692497、JN692496、JF682235)的核苷酸和氨基酸序列一致性分别为71.5%—77.3%和65.7%—79.7%,与其他32个Or MV分离物的核苷酸和氨基酸序列一致性分别为77.9%—99.5%和82.9%—99.2%。基于CP进行的系统发育分析表明,Or MV可分为两个类群,而2677-NL与5个澳大利亚分离物(JQ807995、JQ807996、NC_019409、AF185964、AF185965)相聚成簇,表明其在系统发育关系上与Or MV澳大利亚分离物的亲缘关系最近。【结论】根据国际病毒分类委员会(ICTV)关于Potyviridae科病毒种类的分类标准,2677-NL为Or MV的一个分离物,证实该批番红花种球受到Or MV的侵染。这是世界上首次在番红花中发现Or MV的报道。     

野莴苣及其近似种间亲缘关系研究

利用PCR方法对野莴苣及其11种近似种DNA进行扩增,获得ITS、matK和rbcL序列,分析遗传相似系数和聚类分析图谱,探讨野莴苣及其近似种的亲缘关系。通过野莴苣及其近似种ITS序列分析发现:野莴苣和生菜、莴苣、毒莴苣的相似性分别为93.6%、93.1%、92.6%,野莴苣与乳苣的相似性仅为87.8%;matK序列研究发现:野莴苣和生菜、莴苣、毒莴苣的相似性分别为99.2%、99.0%、99.1%,而野莴苣与乳苣的相似性仅为98.3%,结果表明,野莴苣与莴苣属的生菜、莴苣、毒莴苣的亲缘关系更近,与乳苣属的乳苣亲缘关系次之。通过对比rbcL序列发现:野莴苣和生菜相似度达100%,与莴苣、翅果菊、毒莴苣、刺毛莴苣、宿根莴苣的相似度均达99.7%,而野莴苣与乳苣的相似度却为99.4%,将野莴苣归为莴苣属更加合理。     

不同配方复合肥对籼粳杂交稻化肥减量增效的探索

为了解不同水稻配方复合肥在籼粳杂交稻(‘甬优12’)上的化肥减量增效效果,选择当地常用的4种水稻配方复合肥,以常规施肥为对照,在化肥总养分均减少10.2%的条件下,探索其对水稻的节本增效。结果表明:综合水稻生育表现、经济性状及产量,施用水稻配方专用肥(16-10-14),水稻生育表现佳,化肥成本减少16.90%,增产1.76%,对水稻化肥减量增效效果最好,适合在当地进行推广应用;施用复合肥(20-12-14),水稻综合表现次之,节本增效效果不显著;施用复合肥(22-6-12),水稻综合表现较差,节约的肥料成本不抵减产产值;施用复合肥(15-10-17),水稻综合表现最差,肥料成本上升,产量也下降。     

一种检疫性寄生杂草——小列当

小列当为检疫性寄生杂草,原产欧洲和中东地区,已在世界各地造成了严重的经济损失,本文阐述了其分类学历史、形态特征、生物学特性、地理分布、传播途径、传播历史及危害性,描述了小列当与其近似种在形态特征上的区别及其防治方法,为小列当的检疫鉴定和综合防治提供理论依据。     

余杭区设施青菜水肥一体化应用效果及主要配套技术

在化肥总养分减量50%的条件下,比较水肥一体化与常规施肥在设施青菜上的应用效果。试验结果表明:实施水肥一体化的设施青菜较常规施肥增产8.5%、增收8.8%、节省施肥成本3.0%,增效7391元.hm^-2；可提高青菜后期叶绿素含量,改善青菜农艺性状。同时,结合余杭区生产实际,针对性提出了设施青菜水肥一体化主要配套技术,为该项技术大面积推广应用提供参考。     

辣椒脉斑驳病毒的多基因联合检测与鉴定

【目的】辣椒脉斑驳病毒（Chilli veinal mottle virus,ChiVMV）是辣椒生产上危害严重的病毒,也是口岸检疫的重要病毒之一。本文旨在建立一种快速检测ChiVMV的多基因联合检测方法,实现ChiVMV的快速、准确鉴定。【方法】利用DAS-ELISA、RT-PCR方法对印度进境辣椒进行检测以确定是否携带有ChiVMV。根据ChiVMV外壳蛋白（coat protein,CP）和圆柱状内含体蛋白（cytoplasmic inclusion protein,CI）保守区域分别设计引物,筛选两个基因（CP和CI）的特异性引物组合,通过设定不同的引物用量组合以及对退火温度等条件进行优化,探索最佳的反应条件,建立多基因联合检测方法。利用建立的多基因联合检测体系对包含ChiVMV在内的辣椒病毒进行检测,以验证该体系特异性。同时对ChiVMV阳性样品的不同浓度cDNA进行扩增,测定其检测灵敏度。此外,对田间辣椒样本进行检测,以验证体系的实际应用效果。【结果】通过对印度进境辣椒的DAS-ELISA检测,发现样品提取液与ChiVMV呈阳性反应;利用CP861-F/CP861-R特异性引物对进行RT-PCR,扩增出与预期大小相一致的特异性片段,确认该批辣椒样品携带有ChiVMV。多基因联合检测体系中,应用引物对CP337-F/CP337-R、CI655-F/CI655-R分别扩增出长度为337、655 bp的特异性目的片段。经优化后的反应体系和程序为cDNA 2 μL、CP337-F/CP337-R各0.625 μL（10 μmol·L^-1）、CI655-F/CI655-R各1.375 μL（10 μmol·L^-1）、2×PCR Master Mix 12.5 μL、ddH₂O 6.5 μL,退火温度50℃,共35个循环。建立的多基因联合检测方法具有良好的特异性和灵敏度,两个基因检测灵敏度均为10^-4数量级。实际应用检测结果表明,该方法可从感染ChiVMV的样品中同时扩增出CP和CI的特异性目的片段。【结论】建立的多基因联合检测方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好的特点,可为辣椒脉斑驳病毒的快速检测提供可靠的技术支持。