致病性副溶血性弧菌特异性三重PCR检测方法研究

[目的]建立同时检测致病性副溶血性弧菌gyrase、tdh、toxR基因的三重PCR快速检测方法。[方法]用3种基因的特异性引物分别对副溶血性弧菌ATCC33847的模板DNA进行单一扩增,找到各自引物最佳扩增条件;再用3种引物同步对模板DNA进行扩增,通过优化引物浓度、引物间比例以及退火温度,建立最佳扩增体系。[结果]在最佳三重PCR反应条件下,gyrase、tdh和toxR能同时扩增出清晰条带,大小分别为91、269和368 bp。[结论]该研究为致病性副溶血性弧菌的快速检测提供了一种新的技术方法。     

三疣梭子蟹感染血卵涡鞭虫PCR检测方法的建立

血卵涡鞭虫病是近年来三疣梭子蟹养殖过程中发生的一种危害较大的流行性疾病,患病蟹的体液和肌肉组织中有大量的血卵涡鞭虫寄生.该病多发生于每年9～11月份的夏秋季节,会在短时间内出现死亡高峰.因该病流行范围广、死亡率高、危害严重,对三疣梭子蟹养殖业发展影响很大.本文根据GenBank中登陆的血卵涡鞭虫18S rDNA和ITS1基因序列设计了1对特异性引物,建立了血卵涡鞭虫病的PCR检测方法,从感染血卵涡鞭虫的三疣梭子蟹组织DNA中扩增出产物大小为585 bp的DNA片段.本方法可快速、特异地检测出三疣梭子蟹感染和携带血卵涡鞭虫的状况,为三疣梭子蟹的健康养殖和血卵涡鞭虫病的流行病学调查提供了快速、简便的手段.     

条石鲷(Oplegnathus fasciatus)源美人鱼发光杆菌杀鱼亚种(Photobacterium damselae subsp. piscicida)的分离鉴定

2013年浙江省舟山市某网箱养殖条石鲷(Oplegnathus fasciatus)暴发了一种严重的疾病,病鱼主要症状为脾、肾出现1-2 mm的白色类结节.从患病鱼内脏处分离得到1株优势菌OF-1,经人工感染实验证实为此次引起条石鲷死亡的致病菌,半数致死量为5.93×104 CFU/g.形态学观察结果显示,菌株OF-1为革兰氏阴性、短杆状,在TCBS培养基上不生长.API 20E细菌鉴定系统、16S rRNA系统发育树分析结果证实,该菌株为美人鱼发光杆菌杀鱼亚种(Photobacterium damselae subsp.piscicida).该菌对庆大霉素、青霉素、氟哌酸、氧氟沙星、氨苄青霉素等药物高度敏感,对红霉素、链霉素、卡那霉素、苯唑青霉素等药物具有抗性.     

养殖三疣梭子蟹十足目虹彩病毒1的检出及组织病理学分析

为探究浙江省舟山市某养殖池塘中三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)暴发疾病的病因, 应用组织病理学、 分子生物学和荧光原位杂交等技术手段, 对患病三疣梭子蟹组织进行检验。研究发现, 患病三疣梭子蟹的临床症状主要表现为食欲下降, 行动迟缓, 鳃水肿; 光学显微镜下观察鳃及血淋巴液未发现寄生虫, 肝胰腺等组织中也未分离到致病菌; 采用 PCR 方法对病蟹进行血卵涡鞭虫(hematodinium)、白斑综合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)、青蟹双顺反子病毒(mud crab discistrovirus-1, MCDV-1)以及青蟹呼肠孤病毒(Scylla serrata reovirus, SSRV) 蟹类常见病原 PCR 检测, 结果均为阴性; 病蟹的肝胰腺、心脏、鳃等组织的病理切片中可观察到明显的细胞病变和嗜酸性包涵体; 超薄切片电镜观察显示: 病蟹的肝胰腺、心脏和鳃组织中均存在六边形病毒颗粒, 粒子直径 150 nm 左右, 与已报道的十足目虹彩病毒 1 (decapoda iridescent virus 1, DIV1)形态特征相似。采用特异性套式 PCR 检测方法对患病蟹组织样品进行 DIV1 病原检测, 所有样本均扩增出 457 bp 和 129 bp 大小的目的片段。进一步根据 GenBank 中 DIV1 的主要衣壳蛋白(major capsid protein, MCP)表达基因和三磷酸腺苷酶(ATPase)表达基因序列设计特异性引物, 均能从病蟹样品中扩增出预期大小的 MCP 和 ATPase 基因开放阅读框(open reading frame, ORF)区全长。将扩增获得的 MCP 和 ATPase 基因 ORF 区全长进行测序和同源序列比对分析, 进化树分析结果表明其与十足目虹彩病毒属(Decapodiridovirus)病毒的 MCP 和 ATPase 基因序列自然聚为一支, 判定导致此次三疣梭子蟹发病病原为 DIV1。根据原位杂交探针设计原则, 以 DIV1 的 MCP 和 ATPase 基因的保守区域为靶位点分别设计探针, 通过荧光原位杂交获得了病毒粒子在病蟹肝胰腺、心脏、肌肉和鳃组织的分布情况, 与电镜切片观察和套式 PCR 检测结果相符。研究结果可为海水养殖三疣梭子蟹十足目虹彩病毒 1 病诊断与防控提供参考。     

海产蟹类血卵涡鞭虫间接荧光抗体快速检测技术

以寄生于三疣梭子蟹血淋巴中的血卵涡鞭虫虫体为抗原,制备了多克隆血清抗体.抗体经健康梭子蟹血淋巴吸附处理后,间接ELISA检测效价达7 680.应用该抗体建立了血卵涡鞭虫的间接荧光抗体检测技术(IFAT).采用常规显微镜检、PCR及IFAT 3种方法对采集的养殖青蟹、梭子蟹及海捕梭子蟹等18个样本进行了检测.检测结果显示:常规显微镜检阳性检出率为33.3%,而IFAT及PCR检测阳性率77.8%,符合率达100%;阳性虫体被染上黄绿色荧光,而正常梭子蟹血细胞则未被染色;可检测到血卵涡鞭虫不同生活阶段的营养体、腰鞭孢子及合孢体阶段.为血卵涡鞭虫的流行病学调查及生活史研究提供了简便实用的方法.     

养殖大黄鱼一种黏孢子虫病的组织病理学及检测方法初探

运用组织病理切片、电镜观察及PCR扩增等方法对2017年在舟山采集到的临床表现"白鳃"症状的发病大黄鱼(Larimichthyscrocea)开展了病原学及快速检测方法的初步研究。组织病理观察显示,患病鱼的肝、脾、肾等内脏组织发生严重的病理变化,尤其是组织内红细胞发生明显的退行性变化,同时血液中红细胞数量显著减少。在病鱼组织的电镜超薄切片中可观察到直径约300～600 nm的孢子虫样结构。提取病鱼内脏组织总基因组DNA样本,采用1对针对寄生原虫的通用引物进行SSUrDNA的PCR扩增,最终获得大小为1471bp的特异性条带,经测序比对发现,该条带与GenBank中1种黏孢子虫Sinuolinea sp.的序列同源性最高,达89%。根据获得的SSU rDNA序列,建立了适用于该病临床检测的巢式PCR方法,最小灵敏度可达0.5 pg。研究表明,引起此次网箱养殖大黄鱼"白鳃"症状并导致鱼类大量死亡的是一类寄生性黏孢子虫。     

海产蟹类血卵涡鞭虫病间接荧光抗体快速检测技术

以寄生于三疣梭子蟹血淋巴中的血卵涡鞭虫虫体为抗原，制备了多克隆血清抗体。抗体经健康梭子蟹血淋巴吸附处理后，间接ELISA检测效价达7680。应用该抗体建立了血卵涡鞭虫的间接荧光抗体检测技术(IFAT)。采用常用显微镜检、PCR及 IFAT三种方法对采集的养殖青蟹、梭子蟹、及海捕梭子蟹等18个样本进行了检测。检测结果显示：常规显微镜检阳性检出率为33.3%，而IFAT及PCR检测阳性率77.8%，符合率达100%；阳性虫体被染上黄绿色荧光，而正常梭子蟹血细胞则未被染色；可检测到血卵涡鞭虫不同生活阶段的营养体、腰鞭孢子及合孢体阶段。本文为血卵涡鞭虫的流行病学调查及生活史研究提供了简便实用的方法。     

舟山地区大棚凡纳滨对虾生长缓慢病因的调查分析

2013年以来,浙江省舟山地区大棚养殖的凡纳滨对虾(Penaeus vannamei)普遍出现生长缓慢、养殖成功率低的现象。为了查明该原因,本研究采用分子生物学和组织病理学等方法对引起对虾生长缓慢的病因开展了调查分析。结果显示,采集的270份病虾样本中,对虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)PCR阳性检出率高达85.19%,传染性皮下及造血器官坏死病毒(infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)检出率为0;所有采集的病虾样本中也未分离到常见的致病菌;54份正常的对虾样本中EHP和IHHNV均未检出。将病虾PCR扩增产物进行序列测定和比对分析,结果获得的序列片段与Gen Bank中已有EHP相关序列相似性高达99.55%;病虾的肝胰腺组织病理切片观察显示,在虾肝胰腺组织中可观察到处于各个生长发育阶段的EHP。通过上述研究,初步认为EHP是引起舟山地区大棚养殖对虾生长缓慢的一个重要病原。     

养殖大黄鱼“白鳃病”一种新病毒病原的初步研究

运用组织病理学、电镜观察及PCR扩增等方法对近年来网箱养殖大黄鱼暴发的"白鳃病"进行了研究,以探讨引起养殖大黄鱼"白鳃"关联病毒的致病机理。临床解剖观察显示:患"白鳃病"的鱼表现出极度的贫血症状、鳃丝苍白色、血液稀薄且血细胞数显著减少;内脏组织病理观察结果显示:鱼的肝、脾、肾脏内脏组织发生严重的病理变化,组织内红细胞发生明显的退行性变化,同时鱼体的红细胞数量显著减少;采用针对真鲷虹彩病毒(red sea bream iridoviral virus,RSIV)的引物对病鱼内脏组织核酸样本进行PCR检测,结果显示,患"白鳃病"病鱼样本RSIV核酸呈阴性;组织超薄切片电镜观察结果显示:在患"白鳃病"病鱼脾脏和肾脏组织细胞的胞质中可见直径约40~45 nm的病毒粒子。由此初步判断,浙江地区网箱养殖大黄鱼的"白鳃病"不是由RSIV导致,而与一种直径为45~50 nm的病毒有直接关联,本研究为大黄鱼疾病的诊断与防治提供了参考依据。     

环介导恒温扩增技术检测血卵涡鞭虫

血卵涡鞭虫病是海水甲壳类的重要寄生虫病,其流行范围广、死亡率高、危害非常严重。本研究根据GenBank中已登录的血卵涡鞭虫(Hematodinium sp.)ITS1序列设计了1套引物,该引物可识别目标基因中6个不同区段。以此套引物建立了一种基于环介导恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)的血卵涡鞕虫病诊断方法。特异性试验结果表明,该套引物对血卵涡鞕虫检测具有较高的特异性,能有效检出血卵涡鞕虫。敏感度试验结果表明,该LAMP技术的灵敏度比常规PCR技术高4个数量级。分别运用LAMP和常规PCR技术对25份临床疑似病例进行检测,LAMP方法共检出感染病例25份,常规PCR检出感染病例23份。该技术能在65℃恒温条件下45～60min完成目的DNA的扩增,可直接通过肉眼观察反应产物中是否产生白色沉淀或经SYBRGreenI染色后通过颜色变化、扩增产物的琼脂糖凝胶电泳来定性判断结果,这将为血卵涡鞕虫病的临床诊断提供一种更加简便、快速、实用的方法。