蓖麻成熟期胚抑制消减cDNA文库构建及其差异表达基因分析

利用抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization, SSH）技术,以高含油量蓖麻品种“油蓖5号”开花后第15d胚和36d胚为实验材料构建36d成熟期胚消减cDNA文库。文库的插入片段平均长度约400bp,随机挑取700个克隆进行PCR筛选,获得596个阳性克隆,经过点杂交筛选后选择了521个阳性克隆进行测序。经过同源性比对归并后得到96个差异表达基因,其中包括31个未知基因。已知基因涉及油脂合成、糖的分解、蛋白质贮藏与降解等多个方面。本研究还通过RT-PCR检测了部分可能与蓖麻油脂合成相关基因的差异表达水平,对其可能的功能进行了简要的分析。     

甘蓝型油菜BnADC基因的克隆及原核表达

利用同源克隆和RACE(Rapid amplification of cDNA ends)技术从甘蓝型油菜中克隆到精氨酸脱羧酶(Arginine decarboxylase,ADC)基因cDNA全长序列,命名为BnADC。BnADC全长为2 649bp,包含344bp的5′非翻译区(5′ Untranslated region,5′-UTR)、226bp的3′非翻译区(3′ Untranslated region,3′-UTR)和2 079bp的完整开放阅读框(open reading frame,ORF),编码75.1kD的蛋白质。5′-UTR中含有12bp的uORF (Upstream open reading frame),编码MIRE 4个氨基酸。氨基酸同源性比对表明,BnADC蛋白与其他植物ADC蛋白具有很高的相似性,与芥菜的同源性高达93%;系统进化树分析表明,BnADC与芥菜、拟南芥的ADC亲缘关系较近。在获得全长cDNA的基础上,构建融合表达载体pET30a(+)-BnADC,转化大肠杆菌（Escherichia coli）表达菌株BL21(DE3),SDS-PAGE检测到一个约81.1kD的融合蛋白被E. coil表达,且融合蛋白主要存在于菌体沉淀中。     

HSA转基因水稻二重微滴数字PCR定量检测方法研究

重组人血清白蛋白（HSA, Human serum albumin）基因工程水稻是我国自主研发的可规模化生产水稻重组人血清白蛋白（OsrHSA）的转基因品系，具有极高的推广价值和应用前景，但是目前缺乏对其进行精准定量检测的方法。微滴数字PCR（ddPCR, droplet digital PCR）是近年来新兴的前沿PCR技术，不依赖标准物质即可实现对DNA分子的绝对定量，在转基因产品定量领域被广泛应用。本研究基于ddPCR平台建立了适用于重组人血清白蛋白基因工程水稻（114-7-2品系）的二重ddPCR精准定量检测方法。通过对引物探针的特异性进行验证、对引物探针工作浓度和反应退火温度进行优化，获得最佳反应条件。进而对该方法检测限、定量限和结果重复性做了测定。最后通过对不同含量的重组人血清白蛋白转基因水稻样品进行定量检测，分析比较传统实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）和二重ddPCR的优劣，结果表明本研究建立的转基因水稻HSA/PLD二重ddPCR方法稳定性更好、灵敏度高、成本低廉，精准可靠，适用于不依赖标准物质的精准定量HSA转基因水稻转化体含量分析，可取代qRT-PCR方法进行HSA转基因水稻的绝对定量检测，完善了我国转基因水稻成分精确定量检测技术体系。