急性低氧对团头鲂鳃组织氧化还原稳态及细胞凋亡的影响

为探究急性低氧对团头鲂(Megalobrama amblycephala)鳃组织氧化还原稳态及细胞凋亡的影响, 本研究通过测定超氧化物歧化酶(superoxide dismutases, SOD)、过氧化氢酶(catalases, CAT)活性及丙二醛(malondialdehyde, MDA)的含量, 检测急性低氧胁迫下鳃组织的氧化应激水平, 并采用 Hoechst 染色法观察了团头鲂鳃组织细胞的凋亡, 同时还利用 qRT-PCR 技术检测了团头鲂鳃组织中凋亡相关基因 Caspase 3、Caspase 8 的表达量。结果显示, 在溶解氧含量为(2.0±0.1) mg/L 的低氧环境下, 团头鲂鳃组织中 SOD、CAT 活性及 MDA 的含量均在 6 h、12 h 时显著增加(P＜0.05); 且 SOD 活性与 MDA 含量的变化趋势相同, 均呈上升趋势。此外, 随低氧胁迫时间的延长, 在 6、 12 及 24 h 时鳃组织细胞凋亡的平均荧光强度分别为 0 h 的 2.19 倍(P＜0.05)、2.32 倍(P＜0.05)及 2.59 倍(P＜0.05), 鳃组织中 Caspase 3 与 Caspase 8 基因表达水平均显著高于 0 h(P＜0.05)。研究表明, 团头鲂在急性低氧的水环境中会提高自身的氧化应激水平, 激活凋亡相关基因 Caspase 3、Caspase 8 的活性, 最终促使团头鲂鳃组织发生细胞凋亡。 本研究结果为急性低氧下团头鲂鳃组织的生理状态和细胞凋亡应答情况的研究提供参考。     

ENU诱变草鱼家系生长特性及肌肉生长抑制素基因SNP筛选的研究

经过175 d养殖,对4个N-乙基-N-亚硝基脲(ENU)诱变草鱼家系进行生长对比,采用显著性比较,偏相关分析和因子分析统计方法对草鱼体质量、全长、体长、头长、体高、尾柄长、尾柄高、体厚性状进行分析,进而运用双向测序法对MSTN1、MSTN2基因在具有明显差异家系中进行SNP位点筛选。试验结果显示,家系4的生长速度明显大于家系3,家系4的8个性状明显大于其他3个家系;家系1中体长、尾柄长、体厚与体质量密切相关,家系2中体长、头长、体厚与体质量密切相关,家系3中全长、体长、尾柄高与体质量密切相关,家系4中全长、体长、体厚与体质量密切相关。由此可知,家系4和家系3具有明显的生长差异。对于MSTN1基因,家系3在465位点C/G、467位点G/A,家系4在465位点C/G均发生错义突变;对于MSTN2基因,家系3和4在912位点C/T均发生同义突变,家系3在1027位点G/A、家系4在366位点A/G均产生错义突变,位于非编码区1390位点A/T和1401位点G/A在两个家系均发现SNP位点。试验结果表明,MSTN1、MSTN2基因的不同SNP位点与ENU诱变草鱼的生长性状存在紧密联系。     

团头鲂肠道菌株MA35产纤维素酶分离纯化及性质分析

对团头鲂肠道菌株Aspergillus niveus MA35发酵得到一种内切型纤维素酶采用Q-琼脂糖凝胶FF阳离子交换层析和葡聚糖G-100凝胶层析进行分离纯化。酶的比活力由22.3 U/mg提高到30.6 U/mg。SDS-PAGE结果显示，酶的分子量约为45 ku。该酶水解羧甲基纤维素钠的最适温度为45 ℃，最适pH 4.5，在pH 4.0~8.0以及30~55 ℃之间具有良好的稳定性。在终离子浓度为1 mmol/L以及10 mmol/L下，Zn²⁺、Mn²⁺对酶的活性有激活作用，Mg²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Cd²⁺、Co²⁺对酶的活性有抑制作用，其中Mg²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺抑制作用较强，Na⁺、K⁺、Ca²⁺对酶的活性几乎没有影响。     

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除团头鲂socs1重复基因

以团头鲂细胞因子信号传导抑制蛋白1（SOCS1）基因socs1a和socs1b为编辑对象，在线分析并筛选出合适的靶点合成向导 RNA (guide RNA, gRNA)，然后对1~2细胞期的团头鲂胚胎进行gRNA和Cas9蛋白的混合注射。通过荧光定量PCR技术在转录水平检测socs1a和socs1b的表达，并通过测序平台在DNA水平鉴定基因序列的突变，成功建立了多种socs1的突变品系。与同期野生型(WT)相比，socs1a突变杂合体（SOCS1a^+/-）和socs1b 突变杂合体（SOCS1b^+/-）团头鲂生长性能增强、体质量显著增加，同时炎症因子基因中肿瘤坏死因子α基因(TNF-α)和白细胞介素6基因(IL-6)表达量显著增加，而白细胞介素1β基因(IL-1β)表达无明显变化。注射嗜水气单胞菌后，与野生型不同的是，IL-6和TNF-α在SOCS1a^+/-和SOCS1b^+/-团头鲂肝脏中的表达均有持续显著上升。本实验通过CRISPR/Cas9系统成功敲除了团头鲂socs1a和socs1b，为进一步探讨socs1的作用提供了一定的研究基础，同时为CRISPR/Cas9基因编辑技术在养殖鱼类中的合理应用提供了依据和借鉴。     

鲂鲌杂交及回交F2群体的微卫星遗传结构及其生长性能分析

为了指导团头鲂（、回交F₂的育种工作，对两种回交F₂、一种杂交F₂及两种原始亲本共5个群体的遗传结构及生长性能进行研究。结果表明，团头鲂（MA）、翘嘴鲌（CA）、团头鲂♀×翘嘴鲌2）、翘嘴鲌♀×MC）分别为4.50、4.40、4.75、4.85、5.10，平均观测杂合度（e）分别为0.6671、0.6308、0.6995、0.7240、0.6949，平均多态信息含量（PIC）分别为0.6046、0.5717、0.6406、0.6676、0.6339，BC1-F₂群体的遗传多样性最高（群体大多数位点的Hardy-Weinberg平衡遗传偏离指数显示杂合子过量（2首先聚类，MA与BC1-F₂首先聚类再与MC-F₂聚类，最后这2大类聚为一支。结合Nei’s遗传距离和遗传相似度分析，其杂交与回交后代均具有母本效应。引物Me.Am._15、Me.Am._1、TTF01、Mam25在5个群体中均产生特异性条带，可作为5个群体的鉴定标记。通过对5个群体的生长性能的测量，BC1-F₂群体表现出显著的生长优势。该结果对鲂鲌杂交及回交后代的种质资源保护、种群鉴定及良种的选育具有重要意义。     

新疆额尔齐斯河流域白斑狗鱼的染色体核型分析

采用PHA和秋水仙素胸腔体内注射法,以头肾组织为材料,低渗-空气干燥法制片,对取自新疆额尔齐斯河流域白斑狗鱼的染色体核型进行了分析。经对5尾白斑狗鱼的45个中期分裂相进行显微分析和测量,结果显示:白斑狗鱼的25对染色体均为端部着丝粒染色体,其核型公式为2n=50 t,NF=50。白斑狗鱼染色体大小的绝对值为0.96~1.36μm,平均长度为1.20μm。25对染色体相对长度大小依次递减,大小差异较显著,平均值为5.68。目前,对新疆额尔齐斯白斑狗鱼的染色体组型研究尚未见报道。     

亚东鲑人工繁殖与野生群体的形态和微卫星多态性分析

开展亚东鲑野生群体与人工繁殖后代的形态特征和微卫星遗传多态性分析。首先采用方差、判别、主成分分析方法研究了2个群体,包括7个可数、11个可量与20个框架数据,结果表明亚东鲑人工繁殖后代与野生群体在鳍式、鳞式、可量和框架结构性状等方面均无显著差异。进一步采用9对微卫星引物评估了亚东鲑人工繁殖与野生群体间的遗传变异,在10个座位中,共检测到55个等位基因,平均有效等位基因分别为4.8、4.0个,平均每个座位的等位基因数为5.5个;平均座位观测杂合度分别为0.626 7、0.641 7,平均基因多样性均为0.571 9,群体遗传分化较小,2个群体的微卫星DNA多态性均呈现低水平。结果表明,亚东鲑人工繁殖与野生群体在遗传上差异不大,人工繁殖群体可用于开展进一步的保种繁育和保护性放流工作。     

团头鲂“浦江1号”一个RAPD标记的SCAR转化

从100个10bp寡核苷酸引物的扩增带中，筛选出了3个RAPD特异扩增带，即团头鲂“浦江1号”群体所具有的S37^277bp、S11^2660bp带，以及对照群体所具有的S28^946bp带。该3条RAPD特异扩增带经回收、克隆和测序，并根据部分序列信息分别设计了3对各20bp的正向引物和反向引物。用3对引物分别在“浦江1号”群体和对照群体中进行PCR扩增，分别产生了Sc-1(248bp)、Sc-2(540bp，460bp)和Sc-3(320bp)4个SCAR扩增带。其中，Sc-2(540bp，460bp)和Sc-3(320bp)3个SCAR扩增带在“浦江1号”和对照群体中均呈阳性，不能有效地区分这2个群体；而Sc-1产生的248bp带仅在“浦江1号”群体中出现，对照群体中未出现此扩增带。采用大样本对该Sc-1标记(248bp)进行验证，结果发现，在团头鲂“浦江1号”良种群体的分布频率高达91．1％(82／90)以上，而在淤泥湖原种群体中的分布频率为14．3％(8／56)，Sc-1标记在良种群体中的高频率，可作为检测团头鲂“浦江1号”良种的一个重要的分子遗传特征指标；另外，该Sc-1标记在团头鲂“浦江1号”群体中的高出现频率，也说明了在长期(16年)和高强度(0．03％～0．04％选择率)的选育过程中，团头鲂“浦江1号”已大大提高了某些优良性状基因的等位基因频率。     

团头鲂良种雌核发育群体的建立及其遗传变异

为了巩固经15年选育而成的团头鲂良种－浦江一号的成果，并建立纯系以供进一步研究和开发，1999年和2000年，先后对团头鲂选育系三龄鱼（F5）和二龄鱼（F6）进行了雌核发育（抑制第二次成熟分裂）研究。利用UV照射遗传失活的鲤鱼精子诱导，采用冷,凶制团头鲂第二体排出；探索了适合团头鲂二龄及三龄鱼卵的休克温度、起始时间和持续时间，结果发现：二龄鱼和三龄鱼诱导起始时间均在受精后3min效果最好，而在体温度和持续时间上稍有差异，其中三龄鱼在0－2℃冷休克处理30min、二龄鱼在4－6℃冷休克处理20min效果较好。2年期间，建立了源于选育系3尾雌亲鱼的3个雌核发育群体，共获得正常的雌核发鱼后代1000余尾。RAPD分析发现，选育系群体具有引物S8扩增的1100bp条带，而雌核发育群体具有引物S18扩增的860bp条带；雌核发育群体内遗传相似度显著高于选育系群体，其遗传距离仅为选育系群体内遗传距离的54％。     

Tgf2转座子介导鲤Fst1基因元件在鲤中的转基因效率研究

卵泡抑素(follistatin,Fst)蛋白具有拮抗TGF-β超家族许多成员的功能,通过直接的蛋白结合可抑制肌肉抑制素(myostatin)的活性,从而恢复肌肉的生长,表现出增肌效应。参照鲤高通量转录组测序数据的拼接结果,筛选出鲤卵泡抑素Fst1基因的编码框(ORF)序列(全长1 260 bp,编码320个氨基酸),构建了包含金鱼Tgf2转座子左臂(220 bp)、右臂(185 bp)、斑马鱼Mylz2启动子和鲤Fst1基因ORF的供体质粒pTgf2-Mylz2-ccfst1。通过显微注射方法,并在体外合成的Tgf2转座酶5'加帽mRNA的介导下,获得了一批转鲤Fst1基因的转基因鲤。经PCR检测,转基因鲤Fst1外源基因的整合率平均为44.7%,对其中4尾转基因阳性鲤的扩增产物进行回收、克隆和测序验证,结果表明阳性鲤中均含有转基因目的片段。说明Tgf2转座子转基因系统可在鲤中实现较高的转座效率,为进一步研究卵泡抑素在鲤肌肉发育中的功能奠定了基础。