中华绒螯蟹和罗氏沼虾cyclin B蛋白的原核表达、抗体制备及其鉴定

从中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)和罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)卵巢cDNA中克隆了cyclin B基因的开放阅读框,分别连接到pGEX-2T和pET-32a表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组蛋白GST-EsCB和Trx-MrCB.通过优化培养温度、IPTG浓度以及诱导时间,得出重组蛋白的最佳表达条件分别为:0.1mmol/L IPTG、37℃、4h和0.1 mmol/L IPTG、30℃、6h.重组蛋白主要以包涵体形式存在.亲和层析纯化重组蛋白,作为抗原免疫家兔,制备GST-EsCB和Trx-MrCB多克隆抗体.ELISA检测抗体效价均高达1:80 000,Western blot鉴定该抗体能特异性识别重组蛋白,而且均能够从卵巢总蛋白中检测到cyclin B蛋白.在中华绒螯蟹未成熟卵巢中cyclin B蛋白出现2种亚型,在罗氏沼虾未成熟卵巢中只有1种亚型,推测虾和蟹cyclin B蛋白调控卵母细胞成熟的分子机制不同.本研究制备了cyclin B抗体,旨为在蛋白水平研究cyclin B在卵母细胞成熟过程中的作用机制提供基础条件.     

罗氏沼虾核型及长臂虾亚科核型演化关系的探讨

以略作改进的空气干燥法制备染色体标本，研究罗氏沼虾精巢细胞染色体数目，首次报道了其有丝分裂中期的详细核型。罗氏沼虾染色体数目ｎ＝５９，２ｎ＝１１８，依着线点位置及相对长度不同共划分为Ａ、Ｂ、Ｃ三个染色体组。     

日本沼虾中肠腺细胞的超微结构研究

应用电镜技术研究了日本沼虾中肠腺细胞的类型及超微结构。结果表明：日本沼虾中肠腺上皮细胞大多呈柱状，顶端具有微绒毛，依结构和功能不同可分为Ｒ细胞、Ｆ细胞、Ｂ细胞和Ｅ细胞４种类型。Ｒ细胞具有吸收、贮存营养物质的功能，细胞内含有脂滴、糖原和吞噬咆，内质网、线粒体等细胞器数量少；Ｆ细胞内蛋白酶原合成活动旺盛，粗面内质网极为发达，在数量上比Ｒ细胞多，几乎充满整个细胞；Ｂ细胞微绒毛较短，以胞饮方式吸收营养，在     

细螯沼虾染色体的研究↑（*）

以精巢为材料，研究了细螯沼虾有丝分裂染色体及减数分裂二价体组型。细螯沼虾染色体数目２ｎ＝１００，ｎ＝５０；有丝分裂中期染色体小，呈点状，无法进行核型分析；减数分裂双线期二价体呈棒状，着丝点清晰，染色体总臂数ＮＦ＝１７２，核型公式为Ｎ＝３０Ｍ＋６ＳＭ＋１４ＳＴ，Ｔ。此外，本文还对沼虾属的核型演化关系进行了初步探讨。     

利用AFLP方法筛选中华绒螯蟹性别相关标记

利用AFLP(amplified fragment length polymorphism)技术筛选中华绒螯蟹性别相关标记,共使用192对引物组合检测中华绒螯蟹雌、雄和雌雄混合3个基因组池的多态性,共扩增出5 376条多态性条带,平均每对引物组合扩增出28条多态性条带,获得88条雌雄差异条带。利用雌雄各10个个体再次进行AFLP验证,共62条差异条带具有性别差异,包括两种情况:(1)有49条条带在雌性的4～6个个体中存在,在雄性全部个体中缺失;(2)有13条条带在雄性4～6个个体中存在,在所有的雌性个体中缺失;其余的26条没有性别差异性。差异条带经回收、克隆、测序,结果发现有些条带包含多个序列,共得到77条DNA序列,其中31条序列与鸟类、两栖类和哺乳类等脊椎动物性染色体DNA部分片段具有同源性,相似区间在22～212 bp不等,其中6条DNA序列与命中序列之间具有生物学相关性。设计特异性的引物在基因组中检测,没有获得性别特异SCAR标记。     

罗氏沼虾促雄腺cDNA文库的构建及部分表达序列标签的筛选

促雄腺是甲壳动物雄体特有的内分泌腺,在性别分化中起关键作用.为了获得罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)促雄腺的表达序列标签(ESTs)及可能的功能基因全序列,运用SMART技术构建罗氏沼虾促雄腺cDNA文库,用菌落PCR的方法对cDNA文库进行初步筛选,在筛选的114个阳性重组克隆中随机挑取24个克隆测序,有12条EST序列,其中4个cDNA功能基因,4个rRNA,4个新基因.该研究用SMART技术获得全长cDNA序列的比率较高,同时对分离的四个已知基因的潜在功能进行了初步推断,为进一步筛选与罗氏沼虾促雄腺分化和发育调控相关的功能基因奠定了基础.     

中华绒螯蟹精巢特异表达蛋白DMRT-like:抗体制备及免疫鉴定

Dmrt是性别调控因子Doublesex和Mab-3的相关基因,近年报道了中华绒螯蟹EsDmrt-like只在精巢中表达,为了验证EsDMRT-like蛋白是否在中华绒螯蟹精巢中特异表达及其功能,根据中华绒螯蟹EsDmrt-like基因序列,构建重组质粒pET-32a-EsDmrt-like,转化大肠杆菌BL21,经融合表达和SDS-PAGE分析表明,融合蛋白主要以包涵体形式存在,分子量约为46ku.利用Ni柱亲和纯化融合蛋白免疫家兔,制备获得EsDMRT-like多克隆抗体.Western-blotting检测表明该抗体既能特异地识别重组蛋白,又能特异识别精巢中EsDMRT-like蛋白,并且该抗体仅在精巢中检测到EsDMRT-like蛋白的表达,分子量约为52 ku,为预期单体分子量的二倍.Western-blotting检测变性后精巢总蛋白,该抗体能识别52和34 ku两条条带,证明了二聚体的存在.这一结果暗示EsDMRT-like可能通过形成二聚体形式调控中华绒螯蟹精巢发育.     

中华绒螯蟹促性腺释放激素类似物的初步分离纯化与免疫鉴定

应用反向高效液相色谱法(RP-HPLC)从中华绒螯蟹脑组织提取液初步分离了促性腺释放激素(GnRH)类似物,使用章鱼促性腺释放激素抗体(anti-octGnRH)对分离组分进行免疫斑点印迹实验鉴定,获得了免疫反应呈阳性分离组分,表明脑组织粗提液中含有GnRH类似物分离组分。对该GnRH类似物进行基质辅助激光解吸/电离串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOFMS)分析,结果显示多肽物质分子量范围在800～1400u,主要由8种小分子多肽组成,其中一种组分的分子量与章鱼促性腺释放激素(octGnRH)分子量接近。     

中华绒螯蟹脑和胸腹神经团的组织学观察

利用组织切片技术研究中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)脑和胸腹神经团的形态学和组织学结构。结果表明中华绒螯蟹的脑位于2个眼柄基部之间,由前脑、中脑、后脑和各部分发出的神经束组成;在脑的切片中可以观察到多种髓质和不同类型的细胞体群。中华绒螯蟹胸腹神经团呈圆盘状,靠近腹甲中央,向外发出多条神经束;在其切片中也可观察到多种类型的细胞体群。详细地描述了中华绒螯蟹的脑和胸腹神经团的组织学结构,为进一步研究中华绒螯蟹的神经分泌细胞奠定了基础,同时也为研究其它甲壳类生物的脑和胸腹神经团的组织结构提供参考。