仿刺参微卫星标记的筛选及群体遗传结构分析

采用FIASCO(Fast Isolation by AFLP Sequences Containing Repeats)方法构建了仿刺参基因组富集CA微卫星序列的基因组短片段文库,筛选得到118条微卫星DNA序列。根据重复单元的排列特点,完美型共83个,占70.4%;非完美型共30个;占25.4%;复合型标记5个,占4.2%。选取其中20条微卫星序列设计引物进行多态性检测,并利用这20对引物对采自中国、韩国(西海岸及东海岸)、俄罗斯和日本沿海的野生仿刺参以及美国沿海的具疣拟刺参进行遗传多样性水平和遗传结构分析。结果表明,所设计的20对引物的扩增产物均具有多态性,其中16个位点为高度多态(PIC>0.5)。遗传多样性分析结果显示,20个微卫星座位的平均观察杂合度(Ho)和平均期望杂合度(He)分别为0.39和0.69,共检测到231个等位基因(102个有效等位基因),在每个座位上获得3～20个等位基因,平均等位基因数为11.6个,20个位点在6个群体中不同程度偏离遗传平衡(P<0.05),所有群体在整体上均表现为杂合子缺失(Fis>0);5个仿刺参群体间的遗传相似系数在0.71以上,相似性较高,而仿刺参群体与具疣拟刺参的相似性则较低。聚类分析结果表明,中国群体与韩国西海岸群体聚类成一支,而俄罗斯群体、韩国东海岸群体和日本群体聚类成另外一支,聚类的先后与它们在地理分布上的海域位置有一定的相关性。     

海参“3.15”事件解读及产业可持续发展思考

正对于海参产业来讲,2020年注定是不平凡的一年。7月16日受疫情影响推迟4个月的中央电视台"3.15"晚会播出,第一弹就以《海参"水深"》为标题曝出了海参产业所存在的"不为人知的秘密",被业界称之为海参"3.15事件"。该事件的发生是在冬季冰灾、夏季高温灾害、新冠疫情之后对海参产业的再次大考,给海参产业带     

应用PCR方法检测刺参腐皮综合征病原——灿烂弧菌

腐皮综合征是近年来刺参养殖最主要的疾病,导致刺参大批死亡和惨重的经济损失.根据其主要致病原灿烂弧菌(VibrioQQQsplendidus)的16S～23S间隔区序列,设计特异性引物,利用PCR技术,从纯化的V.splendidus DNA中成功地扩增出产物大小为177bp的DNA片断,并对此方法的灵敏度和特异性进行了研究.结果表明,PCR技术对V.splendidus DNA的检测灵敏度为0.5pg,并且对灿烂弧菌的DNA呈现特异性,而与其他细菌V.Fluvialis、V.Anguillarum、V.Alginolyticus、Aeromonas hydrophila、V.Harveyi、V.Parahaemolyticus、V.Vulnificus的DNA均无交叉反应.应用PCR技术对人工感染的以及取自青岛、烟台和威海的腐皮综合征发病海参进行检测,其检出率均为100%.研究结果表明,PCR方法具有良好的特异性和敏感性,可成功用于快速检测养殖刺参腐皮综合征原灿烂弧菌.在国内,该方法应用于刺参腐皮综合征的检测尚属首次,它将为刺参腐皮综合征的快速诊断及防治提供又一新的方法.     

刺参池塘底栖真核生物DGGE指纹结构与环境理化因子的相关性分析

采用基于18S rDNA PCR-DGGE技术对刺参池塘养殖系统底栖真核生物群落结构与环境理化因子进行分析.结果表明,刺参养殖池塘系统中附着基真核生物DNA指纹图谱均呈现出了丰富的多样性,成参养殖池塘分别获得26、25、25条扩增条带,幼参养殖池塘分别获得20、22条扩增条带；刺参养殖池塘中叶绿素、总磷、总氮、溶氧分别为2.037～5.383 μg/L、0.016～0.039 mg/L、1.863～3.562 mg/L、4.06～6.18mg/L,成参养殖池塘的各项理化指标值均高于幼参养殖池塘.通过指纹图谱和理化因子的聚类分析可以看出,附着基底栖真核生物DGGE指纹图谱与环境中理化因子聚类分析图相吻合,说明不同刺参养殖池塘底栖真核生物群落DNA指纹与养殖环境的理化因子密切相关.本研究通过DGGE技术分析刺参池塘附着基底栖真核生物指纹图谱,进而分析与环境中理化因子的关系,为建立底栖真核生物群落DNA指纹结构与水体理化指标之间的关系提供科学依据.     

一种病毒感染引起半滑舌鳎腹水症的病理学观察

利用石蜡切片技术和电镜技术对患有腹水症的半滑舌鳎Cynoglossus semilaevis Günther主要组织器官进行了组织病理学观察与分析.结果表明:感染腹水症的半滑舌鳎全身主要的组织器官都发生了不同程度的病理变化,其中鳍部皮肤出现血红细胞浸润和淤积;鳃小叶上皮细胞空泡变性,柱状细胞发生炎症;肝胰脏和肾脏都出现了局灶性的组织坏死和溃烂,组织间充满空泡变性的细胞,超微病理观察发现大量病毒粒子;心脏的心肌组织出现固缩和局灶性溃烂;胆囊壁浆膜层结缔组织增生,毛细血管充血;消化道黏膜层和黏膜固有层分离,黏膜固有层成纤维细胞固缩或水样变性,致密层变疏松.根据病理学研究结果初步分析认为,一种未知病毒可能是半滑舌鳎腹水症的主要致病原.     

一株条斑紫菜丝状体黄斑病致病菌病原学研究#br#

采集山东省日照市岚山区藻类养殖合作社某紫菜育苗场的患有黄斑病的条斑紫菜(Pyropia yezoensis)丝状体,经2216E、TSB和TCBS 3种培养基体外培养,筛选获得优势菌株PZ201809121102,通过革兰氏染色、电镜负染观察、16S rDNA鉴定、生理生化分析、药物敏感性等技术方法对菌株进行鉴定分析,并结合回归感染实验确认菌株PZ201809121102的致病能力。结果表明:1)分离纯化后的优势菌株PZ201809121102在2216E海水培养基上的菌落形态呈细小圆形、中间突起、表面光滑呈亮黄色、匍匐镶嵌生长、属革兰氏阴性菌、短杆状、细胞大小(0.5~1.0)μm×(1.5~5.0)μm,透射电镜下观察到该菌株孢外具有单端生鞭毛;2)16S rDNA测序分析表明,该菌在所建16S rDNA系统发育树中与假单胞菌属聚为一支,与浅黄假单胞菌(Pseudomonas luteola)同源性最高,为100%;3)生理生化显示,该菌株在6%NaCl胰胨水、10%NaCl胰胨水中均生长,氧化酶反应阳性,鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶反应阳性;3%NaCl ONPG反应阳性。能同化利用葡萄糖,不能利用蔗糖、乳糖、密二糖、山梨醇等多糖;4)进行回归感染实验时,用10³~10⁸CFU·mL^-1的PZ201809121102菌悬液浸泡感染健康条斑紫菜丝状体。在13 d时,10⁸CFU·mL^-1感染试验组的条斑紫菜丝状体出现大小不一的黄色斑点,与自然发病的丝状体黄斑病症状一致,且可再次分离得到与自然发病丝状体中相同优势分离株,证明PZ201809121102有致病性,是引发条斑紫菜丝状体黄斑病的一种病原,菌悬液浓度小于10⁸CFU·mL^-1的各试验组丝状体中无明显黄斑病患病症状。5)药敏实验结果显示,PZ201809121102对罗美沙星和氟罗沙星两种药物高度敏感,对头孢唑啉、头孢氨苄、头孢拉定不敏感。本研究发现了导致条斑紫菜育苗期丝状体黄斑病的一株浅黄假单胞菌(P.luteola),可丰富对紫菜丝状体黄斑病的认识,以为今后对条斑紫菜育苗期丝状体黄斑病的防治提供参考。     

盐度和溶解氧对刺参非特异性免疫酶活性的影响

测定了不同盐度(20、25、30、35、40)和不同溶氧水平(充空气,DO 7~9mg/L)充纯氧,DO15~20mg/L;不充气,DO 2~5mg/L)对刺参体腔液中酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、溶菌酶(LZM)和超氧化物歧化酶(SOD)活性变化的影响。盐度试验结果表明,盐度急性变化会引起刺参体腔液ACP、AKP、LZM活性的升高和SOD活性降低,其中第10天时盐度对酶活性的影响最大。溶氧试验显示,过饱和溶氧(DO 15~20mg/L)可使刺参体腔液ACP、AKP、LZM、SOD活性维持在较高水平,不充气组(DO 2~5mg/L)刺参体腔液中ACP、AKP、LZM活性出现短暂升高。恢复性试验中,盐度20、25组对AKP活性和盐度20、40组对SOD活性的影响未恢复到初始水平,其余实验组均能恢复至初始水平,说明低盐对刺参免疫力的影响较大。充纯氧组刺参的AKP活性显著高于充空气组,表明高溶解氧水平在一定程度上提高了刺参免疫力。     

养殖刺参“化板症”病原菌的分离与鉴定

本研究对辽宁4家刺参育苗场患“化板症”的稚参进行了病原学分析,从患有“化板症”的稚参体表病灶处分离得到一株优势菌Aj2010072802A90.人工回接感染试验证实,该细菌能使稚参发生厌食、萎缩、降低附着力、溃烂、死亡等现象,具有较强的致病性,为此次“化板病”的病原菌.在此基础上,利用细菌形态观察、生理生化及16S rDNA分子生物学方法对该菌株进行了鉴定,结果显示,该菌为副溶血弧菌Vibrio parahaemol yticus.这是副溶血孤菌导致海参感染的首次报道.此外,本研究针对该病原菌进行了药敏学测试,证实所分离的副溶血弧菌菌株对氟苯尼考等药物高度敏感,相关研究结果将为刺参疾病防控和健康养殖提供了理论依据和技术支撑.     

池塘冷能气雾降温设备对高温期刺参养殖池塘环境理化指标及沉积物细菌群落结构的影响

近年来,极端高温灾害已成为限制仿刺参(Apostichopus japonicus)产业可持续发展的重要瓶颈之一。本团队前期研发出一款可实现池塘养殖刺参安全度夏的池塘冷能气雾降温设备,取得了较好的应用效果。为解析使用该设备对池塘环境的调控作用,本研究选取安装并使用该设备的5个池塘(实验组,根据相对区域的不同,标记为E1和E2组)和无任何降温措施的3个池塘(对照组,标记为C组)为研究对象,测定夏季高温期实验池塘水质及底质指标,并利用高通量测序技术对相应池塘沉积物中菌群结构差异进行解析,进一步分析细菌群落结构与相关环境影响因子的相关性。研究结果显示,2个实验组池塘的底层平均水温显著低于对照组,水体溶解氧含量显著高于对照组,水体氨氮和沉积物氨氮、亚硝酸氮以及化学需氧量均显著低于对照组池塘(P<0.05)。对2个实验组和1个对照组共8个测试池塘的沉积物菌群结构进行测定后分别获得707~880个分类操作单元(optical transform unit, OTU),α多样性计算结果显示,实验组沉积物菌群群落丰度和微生物群落多样性均高于对照组。对8个样品的PCoA分析结果显示,各组内养殖池塘沉积物样本的菌群组成及群落结构相似性较高,组间差异明显。在目水平的物种分布统计结果显示,2个实验组的物种组成相似性较高,实验组中根瘤菌目(Rhizobiales)、乳杆菌目(Lactobacillales)和微球菌目(Micrococcales)的相对丰度显著高于对照组(P<0.05)。LefSe分析筛选到在不同组间存在显著差异的13个细菌群类(P<0.05)。对菌群结构与环境因子的相关性分析显示,参与氮循环过程的微生物种类丰度显著高于对照组(P<0.05),进一步筛选到与实验池塘水体氨氮含量显著相关的3个OTUs,分别为OTU7、OTU29和OTU108,依次归属为变形菌门(Proteobacteria)下的苍白杆菌属(Ochrobactrum)和埃希氏菌属(Escherichia-Shigella)以及厚壁菌门(Firmicutes)下的芽孢杆菌属(Bacillus)。在所预测到的25个原核生物COG代谢途径中,实验组和对照组在18个代谢途径上存在显著性差异(P<0.05)。以上研究结果表明,使用该设备可显著改善池塘水质及底质环境,并影响沉积物菌群结构,相关研究结果可为该设备的推广应用提供数据支撑。     

2种驱鲨方式对海水水质及海水鱼类急性毒性影响

本研究采用模拟生态学的方法,选取化学驱鲨剂和电脉冲驱鲨装置2种驱鲨产品,以牙鲆(Paralichthy solivaceus)、许氏鲆鲉(Sebastes schlegelii)和斑石鲷(Oplegnathus punctatus)幼鱼鱼苗为测试对象,测定不同驱鲨方式使用后对海水水质和鱼苗生理及存活的影响。在不投放鱼苗的水槽中使用相关驱鲨产品测定水质指标的变化。结果显示,化学驱鲨剂的溶解和释放可显著降低水体的透明度和pH (P<0.05),而电脉冲驱鲨装置对水质指标无显著影响。在3种鱼类的养殖水槽中使用相应驱鲨产品,测定结果显示,对照组中幼鱼全部正常,而化学驱鲨剂组的幼鱼鳃和鱼鳍等器官迅速被染成蓝色,幼鱼在15 min内的死亡率达到100%;电脉冲驱鲨装置组的幼鱼除了在设备启动瞬间受到惊扰出现躲避行为外,很快就恢复到自然活动状态,没有出现死亡。由于化学驱鲨剂造成急性死亡,化学驱鲨剂组3种幼鱼的血常规指标无显著变化,而电脉冲驱鲨装置组幼鱼的红细胞和白细胞数量显著升高;化学驱鲨剂组实验幼鱼血液氯离子含量、血糖(GLU)和碱性磷酸酶(AKP)活力等指标显著升高,而血白蛋白(ALB)含量显著降低;电脉冲驱鲨装置组中,牙鲆的GLU和谷丙转氨酶(GPT)活力显著升高,其他幼鱼的血液生化指标无显著差异。组织病理学结果显示,化学驱鲨剂组3种幼鱼鳃、肝脏、脾脏和心脏的器官结构均受到组织损伤。研究表明,与化学驱鲨剂相比,电脉冲驱鲨装置对海水水质的影响较小,且对主要的海水鱼类的毒性作用较小,是一种更为环保的驱鲨方式,相关研究结果将为人类在海洋探索活动中驱鲨方式的选择提供科学依据。