基于转录组测序数据的甘薯SSR标记开发及群体聚类分析

利用转录组数据开发SSR标记,是目前较为经济高效的DNA分子标记开发方法。为了开发更多适用于甘薯的SSR标记,本研究在前期对甘薯体细胞杂种KT1及其两个亲本4个干旱胁迫处理的24个样本转录组de novo测序的基础上,对获得的105 959条Unigene中大于等于1 000 bp的FASTA序列进行搜索,共找到12 105个SSR位点。从中筛选设计了200对SSR引物在KT1及其亲本中筛选验证,最终选择了20对多态性较好的引物,对来自不同地区的94份甘薯种质资源进行了群体聚类分析。聚类分析把94份实验材料分为3个亚群,较清晰地区分了不同材料之间的遗传相似性。这些基于甘薯转录组测序开发的SSR标记为甘薯的遗传多样性分析、辅助育种和遗传图谱构建等研究的开展提供了更加丰富的候选标记。     

小验方

……治便秘方…… 处方:首乌15克,生当归、生赤芍各9克,炙麻仁12克.用法:水煎分3次服,每日1剂.此方药性平和,一般服药2～3天后,大便开始变软,待便秘症状基本解除后,才能停药.功效:养血润肠.主治:便秘、粪便干硬成粒,解时非常困难,甚至要用手指挖出.伴面色多苍白或潮红,或有眩晕、心悸口干,烦热不寐,脉多细数或细软,舌质多红而少津,或舌质淡而津干.     

用改进的SSAP方法克隆抗甘薯茎线虫病相关的RGA

甘薯新品系农大603是从感茎线虫病品种徐薯18的辐照后代中获得的一个抗茎线虫病的突变体。根据已报道的植物线虫抗性基因的核苷酸结合位点(NBS)保守氨基酸序列设计兼并引物，用自行改进的SSAP(modified sequence-specific amplification polymorphisms)方法，对农大603和徐薯18的基因组进行PCR扩增，从农大603中扩增出含有抗性基因NBS保守序列的差异片段2个(片段54和片段72)。在GenBank上序列搜索和比对发现，克隆序列与已报道的植物抗病基因之间同源性较低。根据克隆片段的DNA序列设计引物，以抗、感茎线虫病的甘薯品种的基因组DNA为模板进行PCR扩增，结果显示由片段72设计的引物在抗、感品种上没有扩增出多态性带；由片段54设计的引物在抗病品种和感病品种之间扩增出多态性带，推测片段54是与甘薯抗茎线虫病有关的RGA。     

甘薯耐旱、耐盐突变体的离体筛选

以甘薯品种“栗子香”的胚性悬浮细胞为材料，用PEG6000和NaCl分别作为耐旱性和耐盐性选择剂，对甘薯耐旱、耐盐突变体离体筛选的适宜选择压和筛选方法进行研究。（1）将“栗子香”的胚性悬浮细胞分别培养在含有0-35%PEG和2.0mg/L2,4-D的MS液体培养基中，结果表明，30%PEG为甘薯耐旱性离体筛选的适宜选择压，采用多步选择法和离体重复筛选，由经过γ-射线80Gy照射的900个“栗子香”胚性细胞团筛选得到17个抗性愈伤组织，其中16个再生出植株，（2）将“栗子香”的胚性悬浮细胞培养在含有0-3.0%NaCl和2.0mg/L,2,4-D的MS液体培养基中，结果表明，2.0%NaCl适合甘薯耐盐性离体筛选。采用多步选择法，由900个辐照后的胚性细胞团获得22个抗性愈伤组织，其中20个再生出植株，初步离体鉴定结果表明，这些再生植株比对照表现出较强的NaCl耐受性。     

中国甘薯主要亲本遗传多样性的ISSR分析

用ISSR标记分析了中国62份甘薯主要亲本的遗传多样性, 明确了其遗传差异。结果表明, 17个ISSR引物共检测出490条多态性谱带, 平均每条引物检测出28.8条多态性谱带, 说明ISSR标记是评价甘薯遗传多样性的有效途径之一。62份中国甘薯主要亲本遗传距离为0.158~0.924, 平均为0.574, 通过UPGMA法, 可以聚为2大类, 一类为国内自育亲本, 一类为外引亲本, 说明中国甘薯主要亲本遗传多样性较丰富, 其中自育亲本与外引亲本之间遗传距离较远; 亚洲亲本遗传多样性高于非洲和美洲亲本, 并且与其他亲本间遗传距离较远; 亚洲品种中, 中国大陆亲本遗传距离最小, 为0.419, 与来自中国台湾的亲本差异较小, 但与外引亚洲亲本遗传距离较远。因此, 中国在未来甘薯育种中, 可以国内自育亲本与外引亲本以及外引亚洲亲本与外引其他亲本配制组合, 拓宽中国甘薯品种的遗传背景。     

甘薯抗茎线虫病基因的遗传分析及SCAR标记

以甘薯抗茎线虫病品种徐781和感茎线虫病品种徐薯18的杂交F1分离群体的174株单株为材料,对甘薯抗茎线虫病基因的遗传进行了分析。结果表明,徐781的抗茎线虫病为单基因控制,推测其基因型为Rrrrrr,徐薯18的基因型为rrrrrr。采用BSA-RAPD相结合的方法,筛选940条随机引物,发现10条引物在抗、感池间表现多态性。用这10条引物检测两亲本及建池单株,发现只有引物OPP03在8株抗池单株中扩增出一条在8株感池单株中所没有的特异条带,认为该标记与甘薯抗茎线虫病基因连锁。根据该标记对F1代174个单株的扩增结果,利用Mapmaker3.0软件计算遗传距离,表明该标记与抗茎线虫病基因间的遗传距离为14.2cM。将该片断回收、克隆、测序,表明其长度为878bp,该标记命名为OPP03878。根据测序结果,设计1对特异引物,进行特异性扩增,成功地将OPP03878标记转化为SCAR标记,用亲本及分离群体验证表明该分子标记稳定性好。     

东亚甘薯品种AFLP标记遗传差异研究

甘薯是世界上重要的粮食、饲料、工业原料和新型能源作物,由于遗传背景知识的缺乏,甘薯遗传改良受到限制,东亚是世界上甘薯种植最集中的区域,因此有必要了解东亚甘薯品种的遗传多样性程度和遗传差异。本研究利用AFLP标记对43份来自东亚地区的甘薯育成品种遗传多样性进行了分析。10对AFLP引物扩增出307条谱带,其中多态性谱带占71．7％,平均每对引物扩增22．0条多态性带,表明AFLP标记是一种甘薯遗传多样性分析的高效方法。供试品种间遗传距离为0．0938-0．3359,平均为0．2302,利用UPGMA法可以将供试品种聚为5个组群,表明供试品种遗传多样性程度丰富,东亚甘薯育成品种之间具有较明显的遗传差异。不同国家或地区品种间的遗传距离高于国家或地区品种内的遗传距离。韩国品种与其它东亚国家或地区品种间遗传距离较远。供试品种中,中国大陆品种平均遗传距离最小。作者认为我国甘薯品种改良,应注重与韩国资源的交换,同时在亲本组配中避免少数品种人为过度利用,以保持甘薯品种的遗传多样性,提高甘薯品种改良进度。     

转cry 1Iem基因大豆的培育及抗虫性检测

以大豆子叶节为外植体,应用农杆菌介导法,将抗虫(cry1Iem)基因转化大豆.筛选标记为bar基因.经Glufasinate筛选,获得大量抗性植株.对转基因T_0、T_1、T_2代植株进行PCR检测,初步证明cry1Iem基因已经整合到大豆基因组中.对T2代PCR阳性植株幼嫩豆荚,采用圆盘分隔法接人初孵幼虫,进行初步的抗虫性检测,得到1株具有明显抗虫效果和7株抗虫效果较好的转基因植株.     

植物类胡萝卜素生物合成相关基因的表达调控及其在植物基因工程中的应用

类胡萝卜素是人类饮食结构中不可缺少的重要成分,具有多种重要的保健功能,尤其是有些类胡萝卜素,如β-胡萝卜素是合成维生素A的前体,具有抗癌和提高免疫力等功效。类胡萝卜素还广泛用于医药和化妆品工业。迄今为止,自然界中发现的大多数类胡萝卜素都是微量的中间产物,很难直接利用。本文概述了高等植物类胡萝卜素生物合成途径、类胡萝卜素生物合成关键酶基因的克隆,如异戊烯焦磷酸异构酶、牻牛儿牻牛儿基焦磷酸合成酶、八氢番茄红素合成酶、八氢番茄红素脱氢酶、ζ-胡萝卜素脱氢酶、!-番茄红素环化酶、ε-番茄红素环化酶,并对这些关键酶基因的功能进行鉴定。以水稻、油菜、马铃薯和番茄为例,阐明了类胡萝卜素合成关键酶基因在植物基因工程中的应用。将黄水仙的Psy和Lcy-b以及噬夏孢欧文氏菌(Eriwiniauredovora)CrtI基因同时转入水稻,水稻种子内胚乳类胡萝卜素含量得到提高。另外,在油菜、马铃薯和番茄中转入与类胡萝卜素合成相关的基因,类胡萝卜素含量也发生不同程度的提高,基因表达水平也发生变化。阐述了通过基因操作技术只能得到极少量的类胡萝卜素,只有进一步弄清类胡萝卜素代谢途径,提高外源基因在植物中的特异表达,才能合成大量类胡萝卜素,使类胡萝卜素遗传操作技术成功运用于作物品质改良。     

甘薯高类胡萝卜素突变体农大辐14块根cDNA文库的构建及鉴定

为分析和克隆甘薯块根中类胡萝卜素生物合成的相关基因,以甘薯品种高系14号经60Coγ射线慢照射结合茎尖培养获得的高类胡萝卜素含量突变体农大辐14的块根mRNA为材料,利用Clontech SMART cD-NA LibraryConstruction Kit构建了其cDNA文库.初始文库的独立克隆为0.57×106 pfu,滴度为4.9×106 pfu/mL,重组率为88%,插入片段大小为0.3～2.5 kb,大于0.4 kb的克隆比例为70%,独立克隆数为理论值的3倍.扩增文库的滴度为5×109 pfu/mL.鉴定结果表明该文库可用于基因克隆与分析.