商陆抗病毒蛋白基因的克隆、序列分析及在原核中的表达

 从美洲商陆 (Phytolaccaamericana)叶片中通过异硫氰酸胍法提取出了完整的总RNA ,经RT PCR扩增出缺失突变型PAP基因 ,将该基因与克隆载体pGEM(r) T相连接 ,从SP6和T7两端同时对其进行序列测定 ,共测得 711个碱基 ,与国外报道的PAP基因序列相比较 ,其同源性达 99.6 %。同时将该基因克隆至原核表达载体pET 5a上 ,转化大肠杆菌菌株BL2 1(DE3) plysS ,在 0 .4mmol/LIPTG的诱导下表达 ,经SDS PAGE分析表明 ,该基因在大肠杆菌中得到了特异性表达 ,表达蛋白大小为 2 6ku ,与预期值相符。Westernblotting分析发现该表达蛋白与法国PAP抗血清有特异反应。琼脂双扩散免疫沉淀法鉴定发现表达蛋白与其自己的抗血清及法国的PAP抗血清均能形成免疫沉淀线 ,且这两条沉淀线在相交处呈融合状态 ,说明原核表达的该蛋白与法国从商陆叶片中提取出的PAP具有高度的同源性 ,也说明本试验准确克隆到了PAP基因且在大肠杆菌中得到了表达     

基于酵母双杂交系统筛选灰飞虱体内与大麦黄条点花叶病毒核衣壳蛋白互作的蛋白质

 为了获取影响大麦黄条点花叶病毒(BYSMV)在灰飞虱体内增殖、积累和传播的相关介体因子,本研究利用分离泛素酵母双杂交膜系统,以BYSMV核衣壳蛋白(N)为诱饵对灰飞虱cDNA文库进行了筛选。 将BYSMV N基因构建到诱饵载体pDHB1上进行表达检测和功能验证,结果表明重组载体pDHB1-N能在酵母内正常表达并行使功能。利用诱饵载体筛选pPR3-N空文库对文库筛选条件进行优化,确定3-氨基-1,2,4-三唑(3-AT)浓度为12 mmol·L^-1的QDO平板为筛选文库培养基条件,去除可能存在的轻微筛库背景。在此筛选条件下以诱饵载体从灰飞虱cDNA文库中筛选得到57个阳性克隆,序列比对结果表明这些阳性克隆编码17种候选蛋白,包括表皮蛋白、泛素B、核糖体膜相关蛋白、细胞色素b5以及海藻糖转运蛋白等。 经酵母双杂交共转验证和β-半乳糖苷酶检测进一步确认了这17个候选蛋白与BYSMV N发生互作。本研究成功从灰飞虱分离泛素酵母双杂交膜系统cDNA文库筛选到与BYSMV N互作的蛋白质,为进一步探索弹状病毒与介体昆虫的分子互作机制奠定了基础。     

RNA干扰及其在水稻抗病毒基因工程中的应用

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种基因沉默机制。RNAi作为新兴的基因阻断技术具有明显的优势,已被广泛应用到动植物功能基因组和植物抗病研究中。在抗病毒研究中,人为地将与病毒或宿主基因同源的双链RNA分子导入转基因植株,引起与其同源的基因发生沉默,达到抗病毒的作用。本文主要综述了RNA干扰的相关知识以及在水稻抗病毒基因工程研究中的应用进展。     

大麦黄矮病毒PAV河南分离物通读蛋白ORF5基因的分子特征分析

利用RT-PCR从河南各地采集的110份小麦病样上鉴定出28个大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf viruse,BYDV)PAV分离物,并获得了这28个分离物的通读蛋白(Read through protein, RTP)ORF5基因全长.通过氨基酸序列比对可知,河南分离物RTP-ORF5基因变异普遍较大,28个BYDV-PAV河南分离物RTP-ORF5基因之间的核苷酸序列一致性为75.9%～100%,氨基酸序列一致性为79.4%～99.8%,核苷酸和氨基酸的一致性变异都较大.与国内外报道的16个BYDV-PAV通读蛋白基因相比对,其核苷酸序列一致性为72.2%～99%,由此推导的氨基酸序列一致性为77%～99.6%.系统进化分析显示河南地区分离物在4个内组群中都有分布.这些数据说明河南的大麦黄矮病毒PAV多样性丰富.     

水稻黑条矮缩病暴发流行原因分析——以河南开封为例

水稻黑条矮缩病最早于1963年在浙江省余姚的早稻上发现,1964-1966年在浙江、江苏和上海等地流行或局部危害,1967年后华东地区发病迅速减轻,20世纪70年代在浙江病区难以找到病株,但1991-2002年浙江杂交稻区水稻黑条矮缩病又再次流行成灾,随后发病面积下降。2006年以来在江苏、浙江、山东等稻区大面积发生,并迅速上升为当地水稻主要病害之一,给水稻生产造成了巨大的经济损失。2013-2014年,水稻黑条矮缩病在河南沿黄部分稻区严重发生。本文从稻-麦连作的耕作制度,介体灰飞虱的越冬基数大、带毒率高,田间毒源丰富、易感水稻品种多,介体灰飞虱发生高峰与秧苗敏感期高度重合等方面,分析了水稻黑条矮缩病间歇性暴发流行的原因,以期为该病科学防控提供理论依据。     

一种检测转Bt基因抗虫棉新棉33B和GK-12的PCR方法

测定了转基因抗虫棉新棉33B和GK-12的Bt基因表达盒的序列,发现它们在Bt基因和Bt基因与终止子连接区的序列存在差异,而在启动子与Bt基因连接区的序列完全一致。基于这种结构上的差异,设计3条特异性引物MG-P1、MG-P2和MG-P3,建立了检测这两个转基因抗虫棉的双重PCR方法。采用建立的方法,检测了40个转基因棉花样品,其中,只含有新棉33B的Bt基因结构的样品数为32个;只含有GK-12的Bt基因结构的样品数为6个;同时含有两者结构的样品数为2个。     

人工饲养不同世代灰飞虱群体传播水稻黑条矮缩病毒的比较

为明确人工饲养对灰飞虱传毒能力的影响,本文利用人工饲养至第55代、23代和8代的3个无毒灰飞虱群体,研究灰飞虱携带和传播RBSDV能力的差异。每个群体经饲毒、度过循回期后,选择雌、雄成虫各50头,单头单苗接种1叶1心期健康玉米。接种4 d回收灰飞虱,利用RT-PCR检测带毒率,并调查灰飞虱死亡率;接种43~50 d后调查玉米粗缩病发病率。结果表明:人工饲养55代、23代和8代的灰飞虱群体平均带毒率分别为68.24%、58.93%和62.09%,统计分析表明差异不显著;3个群体平均传毒率分别为31.22%、20.32%和29.91%,55代和8代群体均显著高于23代(P0.05);3个群体平均死亡率分别为54.19%、65.24%和77.72%,其中55代群体极显著低于8代(P0.01),二者与23代群体差异不显著。3个群体灰飞虱的带毒率63.09%高于传毒率27.15%,差异极显著(P0.01)。结论:人工群体饲养至第55代的灰飞虱与仅饲养至第8代的灰飞虱在携带和传播RBSDV方面未发现显著差异,且均保持了较好的能力。     

商陆抗病毒蛋白基因在麝香百合中的转化和表达

以麝香百合叶片愈伤组织为受体,利用根瘤农杆菌介导法将美洲商陆蛋白（PAP）基因和抗卡那霉素筛选基因以共转化的方式转入百合叶片愈伤组织中,然后在含有MS培养基中筛选愈伤组织并得到再生植株,在建立的农杆菌转化百合的遗传转化体系中,获得49株再生植株,经PCR检测表明PAP基因已经转移到有抗性愈伤组织再生出百合植株中。     

河南省小麦叶枯类病害研究现状

河南省小麦叶枯类病害研究现状＊王锡锋刘红彦张忠山（河南省农业科学院植保所郑州４５０００２）小麦叶枯类病害７０年代仅在河南省局部地区零星发生，８０年代初因大面积推广阿夫系统小麦和生产条件改变，发病面积逐年增加，８０年代中期已遍及全省大部分麦区。１９９...