4种动物虫媒病病毒多重RT-PCR检测方法的建立

分别设计和合成4对特异性引物,通过对反应条件的优化,初步建立了鉴别蓝舌病病毒(BTV)、鹿流行性出血病病毒(EHDV)、水疱性口炎病毒(VSV)和赤羽病病毒(AKV)的多重RT-PCR检测方法,并对其特异性和敏感性进行了检测。结果表明,所设计的4对引物可对同一样品中的VSV、BTV、EHDV和AKV进行特异性扩增,所扩增的目的片段的长度分别为301、351、537、250bp。建立的四重RT-PCR检测方法能够检测出10-7稀释的细胞培养病毒液,4种病毒之间没有发生交叉反应,说明该检测方法特异性强,敏感性较高。所建立的多重RT-PCR方法可用于上述4种动物虫媒病病毒的快速鉴别诊断,在动物检疫、临床诊断和流行病学调查方面具有较好的应用前景。     

单一引物标记LUX荧光RT-PCR鉴别BTV和EHDV

采用在线LUXTM专业软件,根据BTV-NS3基因序列和EHDV-NS3基因序列,通过特异性单一引物序列3′末端的荧光标记,分别设计出两对BTV和EHDV的LUX荧光PCR引物,并采用BLAST软件对各引物进行匹配性和特异性分析,根据分析结果选择合适的引物合成。经过各反应条件的优化和特异性、敏感性试验,并对BTV、EHDV、VSV、PPRV、BVDV、AKV的BHK-21细胞培养物和临床样品检测,与常规RT-PCR进行对比检测,建立了能同时鉴别检测BTV和EHDV的二重LUXTM荧光PCR方法。该二重LUXTM荧光PCR的BTV和EHDV各自引物只对相应的病毒呈阳性反应,两者没有交叉反应现象,对健康牛、羊和猪基因组DNA、BKH-21细胞对照,以及其他几种相似疾病如VSV、PPRV、BVDV、AKV均呈阴性反应。该法对病毒的细胞培养液鉴别检测敏感性可达1TCID50C以上,比常规RT-PCR敏感性提高10倍以上,从样品核酸纯化到完成二重LUXTM荧光PCR反应和熔解曲线分析,仅需3h,在进出口动物检验检疫中快速鉴别BTV和EHDV具有实际应用价值。     

应用实时荧光定量TaqMan RT-PCR检测口蹄疫病毒

按照口蹄疫病毒(FMDV)聚合酶3D基因序列,设计合成了引物和探针,经各反应务件的优化,建立了实时荧光定量RT-PcR技术,对细胞培养物、水泡液、水泡皮及分泌物、血液中的FMDV进行了特异性检测和敏感性试验。结果,用300nmol／L的引物浓度和200nmol／L探针浓度,获得的CT值较小,而△Rn最大;可检测到相当于9．1TCID50的病毒RNA;与VSV和其他水泡性病毒不发生交叉反应;制作的标准曲线中各浓度范围内有极好的线性关系,且线性范围宽,相关系数为0．984;组内和组间试验重复性的变异系数(CV)分别为5．4％和6．7％;与常规RT-PCR相比较,该方法具有快速、特异、敏感、可定量,并可同时检测大量样品等优点。     

赤羽病病毒N基因硫氧还蛋白融合表达载体的构建与表达

为获得赤羽病病毒(Akabane virus，AKAV)的核蛋白重组抗原，根据其基因序列(S mRNA)设计合成了1对特异性引物，对AKAV N基因进行RT-PCR扩增，产物大小约为696bp，回收纯化后，将其克隆至pMDl8-T质粒栽体中，经核苷酸序列分析，与已报道的多株AKAV编码核衣壳蛋白N的S mRNA基因比较后发现，所测定毒株的核苷酸序列与TIN毒株的同源性高达98．3％，推测的氨基酸同源性为97．6％，证实为AKAV的N基因。将该基因片段亚克隆插入pBAD／Thio TOPO表达栽体，转化TOPl0细胞，成功地构建了AKAV N基因重组表达栽体。经L-araboinose诱导表达，可稳定、高效地表达AKAV核蛋白抗原。表达蛋白为融合蛋白，分子质量约42．5ku，其表达产量约占茵体总蛋白的28％，融合蛋白中含有AKAV特异性核蛋白抗原，可作为ELISA包被抗原。     

转基因动物产品-人乳铁蛋白与测定方法

乳铁蛋白是一种分子量为76.386kDa的结合性糖蛋白，在其多肽链上有两条碳水化合物侧链，乳铁蛋白存在于人乳及牛乳中，乳腺为主要分泌器官，乳铁蛋白具有多种重要的生理功能，在多种免疫细胞表面存在乳铁蛋白受体，编码人乳铁蛋白的基因全长2.358kb，由其释译的最初乳铁蛋白为711个氨基酸残基，成熟乳铁蛋白为692个氨基酸残基，人乳铁蛋白的转基因研究已获成功，获得表达，并初步应用于临床治疗，乳铁蛋白的检测方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA），放射免疫（RIA），免疫卵迹(Western-Blot)及免疫组化方法，还可应用PCR和核酸探针技术对人乳铁蛋白转基因肉品进行检测。     

猴艾滋病(SAIDS)及其检疫方法简介

1983年,美国加利福尼亚州、华盛顿、新英格兰、俄勒岗等地区灵长类中心的猴群中相继发现类似于人类获得性免疫缺陷综合征(AIDS,艾滋病)的免疫缺陷性疾病。受感染的猴表现为T淋巴细胞功能缺乏、致死性机会性感染和淋巴细胞增生性异常。临床     

同群鹌鹑发生新城疫和痘病初报

昆明市郊某公司鹌鹑养殖场,饲养着三万余只鹌鹑,除6000余只产蛋外,其余为育成鹌鹑。1985年11月26日突然大批死亡,每日死亡高达1000余只,一周内损失鹌鹑12000余只,产蛋从每日13公斤下降到5.6公斤。经临床检查、病理解剖和病毒分离,确诊为鹌鹑新城疫和鹌鹑痘的同时流行。两种病毒性传染病在一个鹌鹑场同时发生,尚属罕见,现报道如下。     

检验检疫新技术研究进展

最近几年才兴起的生物芯片、核酸序列依赖性扩增法（NASBA）及荧光定量PCR技术同传统的实验方法相比有灵敏性高。特异性强，快速，高通量等优点，而倍受中外学者的青睐。但仍有好多初学者对这方法的知识了解甚少，为了解决这一问题．本文就从生物芯片、核酸序列依赖性扩增法及荧光定量PCR的定义、原理、检测中的应用和各自的优点做一简单的综述，以便相互之间的学习和进步。     

实时荧光定量RT-PCR检测猪水疱病病毒的研究

按照猪水疱病病毒结构蛋白VP1基因序列,设计合成引物和探针,经各反应条件的优化,建立了实时荧光定量RT-PCR技术,对猪水疱病病毒进行了特异性、敏感性和重复性试验。结果表明,实时荧光TaqManRT-PCR可检测到每个反应相当于1×102拷贝病毒RNA;与FMDV、VSV等其他水疱性病毒不发生交叉反应;制作的标准曲线中各浓度范围内有极好的线性关系且线性范围宽,相关系数为0.993;与常规的RT-PCR比较,该方法具有快速、特异、敏感、重复性好、可同时检测大量样品等优点。